165227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szájhigiéniában használható enzimek és ilyen enzimeket tartalmazó készítmények előállítására
7 165227 8 1. példa Cariogenanáz meghatározása A cariogenant hidrolitikusan bontó mikroorganizmusok utáni kutatáshoz szénhidrátforrásként carioge- 5 nant tartalmazó agar táptalajt alkalmaztunk. Az agar táptalaj összetétele az alábbi volt: 100 mg tripticáz, 1,5 g agar. 200 mg cariogenan, 0,1 ml a streptococcus táptalajánál leírt sóoldat pro 100 ml 0,1 M 7 pH-jú fosztat puffer. A táptalajt 15 percig autoklávban 10 kezeltük. Mintegy 10 ml szuszpendált cariogenant tartalmazó fenti táptalajt 100 x 20 mm-es méretű fetri csészébe öntöttünk. A Petri csészéket miután a levegő mikroorganizmusaival érintkezésbe hoztuk 10 napig 28 C°-on tartottuk. A hidrolitikus enzim 15 keletkezése jól megfigyelhető a tenyészet körül kitisztuló cariogenan tartalmú agar-szuszpenzióban. Több aktív mikroorganizmust találtunk, amelyeket a cariogenan tartalmú agar-szuszpenzió feltisztulásának mértékével határoztunk meg. Ezeket izolálás céljából 20 továbboltottuk azonos összetételű agar lemezekre, ilyen módon az alábbi mikroorganizmusokat sikerült izolálni: NRRL 5305 számú, nem azonosított gomba (MF^1490); NRRL 5306, 5307, 5308 és 5309 számú Streptomyces sp. (MA-4226, 4227, 4228 és 4229); 25 NRRL B-5301, B-5302, B-5303 és B-5300 számú Bacillus sp. (MB 2793, 2794, 2796 és 2665) továbbá NRRL B—5310 számú Corynebacterium sp>. (MB— 2795). Az NRRL B-5300 számú Bacillus sp. (MB—2665) tenyészetet a találmány szerinti eljárás 30 céljaira különítettük el, de bármelyik másikat is fel lehetett volna használni. A Bacillus sp. MB—2665 tenyészetet a fentiekben leírt módon cariogenan tartalmú agar lemezeken izolálás és L-csövekben való tárolás céljából tenyész- 3b tettük tovább. 2. példa 40 Cariogenanáz előállítása A cariogenanáz előállítását 2 literes 400 ml alábbi összetételt tartalmazó nyitott edényben végeztük: 800 mg táptalaj, 800 mg élesztő kivonat, 800 mg 45 trypticáz, 0,20 ml fenti sóoldat, 8 mg cariogenan (nem szükséges minden tenyészetbe) pro 400 ml 0,1 M 7 pH-jú foszfát tompító oldat. 15 percig 121 C°-on autoklávban kezeltük, majd a táptalajt 1 ml 48 órás 50 ml térfogatban készített tenyészettel (250 ml-es 5Q rázótölcsérben) oltottuk be; a táptalajnak az összetétele az alábbi volt: 10 g Aradamine (autolizált élesztő termék, Yeast Products Inc.), 10 g dextróz, 180 mg KH2 OP 4 , 190 mg Na 2 HP0 4 ; 50 mg MgS04 .7H 2 0, 1 liter desztillált vízben oldva. A 55 tenyészetet (MB-2665) 37 C°-on, 200 fordulat/perc sebességgel rázógépben rázattuk. A táptalajt, amikor a szuszpendált cariogenan feltisztult, rendszerint 72 és 96 óra között, leszűrtük. 60 3. példa Cariogenanáz izolálása A táptalajt centrifuga alkalmazásával megtisztítjuk 65 a sejtektől és egyéb oldhatatlan részektől; a műveletet 20 percig 2 C -on 16 000-es fordulattal végeztük. A tiszta felülúszót vákuumban koncentráljuk (400 ml-t 40 ml-re), majd az elegyet hűtőfűrdőbe téve -60 C°-on 2—3 ml-es adagokban acetont adunk hozzá, amíg az aceton végső koncentráció 60% nem lesz. (térfogat/térfogat). A lecsapott anyagot centrifuga alkalmazásával gyűjtjük össze, a műveletet 10 percig -20 C°-on 1500-as fordulatszámmal végezve. A csapadékot azonnal 200 ml jég hideg 0,5 M 7 pH-jú foszfát pufferba szuszpendáljuk. Az így kapott szuszpenziót 60 percig kevertük, majd az oldhatatlan részeket centrifuga alkalmazásával különítettük el, a műveletet 20 percig 2 C°-on 13 000-as fordulatszámmal végezve. A tiszta halványsárga felülúszót ammónium szulfáttal telítettük. A csapadékot 20 percig 2 C°-on 13 000-es fordulatszámmal végzett centrifugálással tömörítettük. A csapadékot 40—60 ml jéghideg desztillált vízben oldottuk, majd 24 óráig dializáltuk. A tiszta oldatot fagyasztva szárítottuk. A kapott anyag (150-200 mg-os hozam) 400-550 egység/mg cariogenanáz aktivitást képviselt. 4. példa Cariogenanáz izoelektrofokűszálása Az izoelektrofókuszálás műveletét LKB 110 ml térfogatú Chaiet és társai által leírt (Applied Microbiol 20, 421 (1970) elektrofókuszáló oszlopon végeztük, és 5,1 értéket határoztunk meg. 5. példa Cariogenanáz-egység meghatározása A cariogenanáz-egység meghatározását arra a megfigyelésre alapoztuk, hogy a cariogenan szuszpenzió feltisztulásának százalékos értéke és az idő logaritmusa között lineáris összefüggés van. Az anyag feleslegét alkalmazva, az egyenes hajlásszöge az enzim aktivitás értékét adja meg. Egy adott enzim-készítményből hígítás sorozatot készítve összehasonlító görbét szerkesztettünk, a hajlásszög értékét egy önkényes lineáris beosztású aktivitás egységre felvéve. Az összehasonlító rendszer 3,25 mg szuszpendált cariogenant (a 0,05 M 6 pH-jú foszfát puffer oldat ml-enként 1,0 mg cariogenant tartalmazott) és 0,50 ml hígított enzimet tartalmazott, a hígítást oly módon választva meg, hogy 4—22 hajlásszög 5 óránál magasabb inkubációs periódust eredményezzen. Magasabb enzim tartalomnál a görbe határértéket mutat. Az inkubálást 37 C°-on rázógépbe helyezett zárt küvettákban végeztük, az optikai sűrűség értékét 620 nm-en 0, 1, 3 és 5 óra elteltével mértük. Nem lineáris vizsgálati rendszerben például az 5-ös hajlásszög értéke 6 egység/ml-nek, a 10-es érték 16 egység/ml-nek és a 20-as érték 62 egység/ml-nek felel meg. 6. példa A cariogenan aktivitás optimális pH-értéke A cariogenanáz pH optimumának értékét a szokásos vizsgálati módszerrel határoztuk meg 4,9—8,0 pH-jú tompító oldatban mérve (0,1 M Soernsen) a cariogenan szuszpenzió diszperzió százalékát. A disz-4
