164928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-(szubsztituált hidrazono-metil) rifamicin SV származékok előállítására
7 164928 8 England Nuclear, 18,6 mCi/ji.mól, liofilizáiva és feloldva 0,01 m sósavban közvetlenül felhasználás előtt) és dATP-t (8xl0"5mől, szintetikus templáttal), vagy mind a három dezoxinukleozidtrifoszfátot (8 x 10" 5 mől RNS vagy DNS irányitott reakciókkal). Némelyik kisérletben az enzimet nem inkubáltuk előre az inhibitorral. Ezekben az esetekben a reakciókat ugy iniciáltuk, hogy az inhibitort tartalmazó teljes reakciókeverékhez adagoltuk az enzimet. Az inkubáció megkezdésekor és 30 perc múlva mintákat vettlink, ezekben a folyamatot 2 ml 0, 08 mől nátriumpirofoszfáttal befejeztük és 12,5%-os hideg triklórecetsavban (TCA) hordozóként élesztő-RNS-val(400j^g) kicsaptuk. A terméket Millipore szűrőn összegyűjtöttük, alaposan átmostuk 5% TCA és 1 ml DNSO-etilalkohol-0,1 mól nátriumklorid keverékkel, szárítottuk és Packard-féle folyadék-szcintilláciős számlálóban 2 ml BBSo-ban (Beckman) és 10 ml 11-quifluorban (New England Nuclear) megszámoltuk. Azt találtuk, hogy az 5-20 ug/ml-es koncentrációk szintetikus DNS templáttal a leukaemias polimerázt 50%-ban gátolják. A. szintetikus templáttal (poly rA. rU) irányitott reakció még érzékenyebb volt. Természetes templáttal, normál és tumor -sejt-polimerázon végzett reprezentatív kisérletek szerint a tumor-enzimek érzékenyebbek voltak a vizsgált vegyületekre. Azuj rifamicin-származékok egyéb biológiai jellemvonásai: egér, patkány és ember sejtjeinél a Moloney és Kirstein-féle egér-sarcoma virustörzs által előidézett fókuszképződést gátolják; a már transzformált egér és emberi sejtek virustermelését szelektive gátolják; a visszafejlődő sejtek kimutatása, egér-sarcoma virus által transzformált nem-termelő egér és patkány sejtrendszereket használva. A találmány szerinti hidrazon vegyületek ezenkívül szelektív toxicitást mutatnak virustranszformált egér, patkány és emberi sejteknél, ha azok kolóniaképző képességét vizsgáljuk. A vegyületek gátló hatását BALB/3T3 szövettenyészeten Moloney sarcoma-virus által előidézett fókuszképződésre a következő eljárással vizsgáltuk: BALB/3T3 sejtkulturákat tenyésztettünk 250 mles műanyag palackokban "Eagle-féle minimális szükséges táptalaj"-t és 10% foetális marhaszérumot tartalmazó táptalajon. A sejteket tripszin-EDTA-val szuszpendáltuk és táptalajjal hígítottuk, majd a sejtszámlálást Coulter számlálóval végeztük. Tumor-homogenátumként Moloney egér-sarcoma virust használtunk. Négy passzázst végeztünk svájci származású nagy passzázs-számu egérembrió sejttenyészetben és a fókuszképző egységeket BALB/3T3 sejtekben vizsgáltuk. A vizsgálatok elvégzéséhez a Hartley és Rowe, Proc. Nat. Acad. Sei., 55, 780 (1966) által leirt módszer módosított változatát alkalmaztuk. Jelen esetben a palackokat 25 ml táptalajban levő 1-2 x 10° sejttel beoltottuk és 37°C-on24 óráig inkubáltuk. A folyadék eltávolítás a után az előre meghatározott számú fókuszképző egységekkel rendelkező virust 0, 5 ml táptalajra helyeztük és a sejtek egyetlen rétegén 37°C -on, 90 percig adszorbeáltattuk. Ezt az adszorpciós periódust követően előre mégha-. tározott mennyiségű, rendszerint kb. 5-10fig/ml hidrazono-rifamicin vegyületet (amit előzőleg 1, mg/ml-es koncentrációban dimetilszulfoxidban oldottunk) adagoltunk hozzá 25 ml táptalajban és a 5 kultúrákat visszatettük az inkubátorba. Kontrollként csak dimetilszulfoxidot tartalmazó táptalajt adtunk egy külön tenyészethez. 3 napos inkubálás után a kultúrák folyadékát cseréltük és a hetedik napon megszámoltuk a transzformált sejtek fóku-10 szait. Ugyanilyen módszerrel vizsgáltunk New Jersey szerotipusuvesicularis stomatitis virust is. Az ennek a vírusnak a tenyészetéhez és vizsgálatához használt módszert Hackett és társai, Virology, 31, 15 114 (1967) írták le. Ezek a tulajdonságok bizonyítják, hogy a találmány szerinti vegyületek vírusok által előidézett tumorokra hatékony gátló hatást gyakorolnak. A találmány szerinti vegyületek előállítását pkö-20 vetkező példák szemléltetik. 1. Példa 25 3-(2-ciklooktilidén-hidrazono)-metil-rifamicin SV 1, 3 g ciklooktanont 10 ml tetrahidrofuránban feloldunk és 0, 5 g 98%-os hidrazinhidrátot adunk hozzá. Az oldatot egy órán keresztül visszafolyató hü-30 tő alkalmazásával forraljuk, majd az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, így 0, 90 g olajos maradékot kapunk, ez a nyers ciklooktilidénhidrazin. Ezt a nyers terméket 300 ml tetrahidrofuránban oldott 4,5 g 3-formil-rifamicinhez adjuk. 15 perc 35 után az oldatot bepároljuk és a szilárd maradékot oszlopkromatográfiával, szilikagélen tisztítjuk. A tisztításhoz eluensként kloroformot, majd olyan kloroform-metilalkoholelegyeket használunk, amelyek maximum 1, 5% metilalkoholt tartalmaznak. 40 Az oszlopkromatográfiás eluátumből kinyert szilárd terméket metilalkoholból kétszer átkristályositjuk. A hozam 1,5 g. Az olvadáspont 252-256°C, eközben az anyag bomlik. Analízis a C, .H,,No 0,„ összegképletre: Jr. 46 61 3 12 45 számított: C 65,15; H 7,25; N4,95%; talált: C64.95; H 7,22; N 5,10%. \ = 480; 333; 260, váll 505-nél; er, ""max E1 / 0 = 166; 280; 326. 1 cm 55 2. Példa 3-(2-benzilidén-hidrazono)-metil-rifamicin SV 10 ml tetrahidrofuránban oldott 750 mg 3-for-60 mil-rifamicin SV-hez 150 mg benzilidénhidrazont adunk és szobahőmérsékleten kevergetjük. A reakció 20 perc után fejeződik be. A keveréket bepároljuk és a nyers terméket metilalkoholból átkristályositjuk. A hozam 500 mg, olvadáspont 203-214°C, 65 bomlással. 4
