164927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-alkenil-rifamacin SV-származékok előállítására
7 16492 7 8 New Biology, 232, 141 (1971)]. Mind a Rauscher , mind a Moloney tipusu vírusokat előzetesen tisztítottuk, megkötve azokat szacharóz l,16g/mlfajsulygrádiensü tartományában, miután kezdeti kis sebességű centrifugálással a sejttörmeléket eltávolítottuk. A viruskészitmény végső koncentrációja 10 részecske/ml. Templátként endogén 70S RNS-at alkalmaztunk. Azt találtuk, hogy 50/».g/ml vagy ennél kisebb koncentráció hatásosan gátoljaaz enzimet. Hasonló eredményeket kaptunk, ha emberi eredetű tumorsejt-polimerizátokat használtunk. Ebben az esetben a gátló hatást normál sejtpolimerázokon is tanulmányoztuk, hogy a szelektív hatást jellemezzük. Az (I) általános képletnek megfelelő rifamicin-származékok hatását két tisztított DNS-polimerázon értékeltük, amelyeket 1. emberi normál (PHA-stimulált) vér lymphocytáiből, 2. lymphoblast sejttenyészetből (normál donortól származó) és 3. emberi leukaemias vér lymphoblastjából különitettük el. Szintetikus és/vagy természetes tempiátokat használtunk. Az alábbiakban ismertetjük a kísérleti eljárás egy jellegzetes példáját: Emberi vér lymphoblastok Leukaemias lym phobias tokát izoláltunk leukophoresis által előidézett acut lymphocytás leukaemiában (ALL) szenvedő páciens perifériás véréből. A. sejteket mostuk és az erythrocytákat eltávolítottuk hipotóniás lizissel. Normál lymphocytákat egészséges donor perifériásvéréből vettünk, miután agranulocytákat nylonoszlopban végzett kromatografálásával eltávolítottuk. Ezeket phytohaemagglutininnel (PHA) stimuláltuk 72 órán át [Gallo és társai: Nature, 228,92 7 (1970); Gallo és társai: Science, 165, 400(1968)], hogy a DNS-polimeráz-aktivitást a maximumra növeljük. Ezeknek a sejteknek elegendő nagy menynyiségben való előállítása azonban problémát jelent, ezért a kezdeti tájékozódó vizsgálatok céljaira alkalmas kevésbé tisztított DNS-polimerázok előállításához emberi "normál" szövet-sejttenyészeteket (1788) használtunk. Az érdekesnek látszó vegyületeket azután normál és leukaemias vér lymphocytáiből előállított, erősebben tisztított enzimekkel részletesebben tovább vizsgáltuk. Ezeket a szövettenyészet-sejteket az Associated Biomedic Systems, Inc. bocsátotta rendelkezésünkre. DNS-polimeráz készítmények Sejt DNS-polimerazokat extraháltunk és tisztítottunk normál vér (PHA-al stimulált) lymphocytáiből, leukaemias vér lymphocytáiből és (1788) limphoid sejtekből, hipotóniás pufferoldatban végzett homogenizálás sal. Ezt követően az extralizozomális részecskéket Triton X 100-zal és/vagy erős sós extrahálással eltávolítottuk. Differenciál-centrifugálás után a sejtextraktumokat DEAE-cellulőzon, foszfocellulózon és Sephadex G 200-on végzett oszlopkromatográfiával tovább tisztítottuk. DNS-polimeráz vizsgálata A DNS-polimeráz vizsgálatát 100,u,l végső térfogatban végeztük. Avizsgálandó keverék tartalmazott 50 mmól trisz-HCl puffert (pH = 8,3), 6, 0 mmől magnéziumacetátot, 8, 0 mmól ditiotreitet és 6,0 mmól nátriumkloridot. A pH beállitását az előzetesen dimetilszulfoxidban feloldott inhibitor-vegyületek hozzáadása után végeztük. -A dimetilszulf-5 oxid végső koncentrációja 0, 5% volt és a kontroliminták is ilyen mennyiségű dimetilszulfoxidot tartalmaztak. A vizsgálathoz olyan enzimkoncentráciőt használtunk, ami mintegy 1, 0 pmől/óra beépülést katalizál. Az enzimet a legtöbb esetben az in-10 hibitor-vegyülettel 5 percig előinkubáltuk. A reakciót ugy indítottuk be, hogy templátként szintetikus DNS-at (poli d(AT) Miles Lab.) és DNS.RNS hibridet (oligo dT. poli rA) 5juLg/ml koncentrációban, vagy természetes templátokat: aktivált lazacsper-15 ma DNS-at 50/j.g/ml koncentrációban és endogén 70S virális RNS-at alkalmaztunk; továbbá lOjuCi (3 H-metil)-TTP-ot (New England Nuclear, 18, 6 mCi)/imól, liofilizálva és újra oldva 0,01 mólos sósavban(közvetlenüla felhasználás előtt) és dATP-ot 20 (8 x 10 D mól, szintetikus templáttal), vagy mind a három dezoxinukleozidtrifoszfátot (8 x lO'^mől, RNS- vagy DNS- irányított reakciók). Némely kísérletben az enzimet és az inhibitor-vegyületet nem inkubáltuk előre. Ezekben az esetekben a reakciót 25 ugy indítottuk be, hogy az enzimet hozzáadtuk az inhibitor-vegyületet tartalmazó komplett reakciókeverékhez. Az inkubáció megkezdésekor és 30 percinkubálás után mintákat vettünk, ezekben a folyamatot 2 ml 0,08 mólos nátriumpirofoszfáttal be-30 fejeztük és 12,5%-os hideg triklőrecetsavbanélesztő-RNS-val (400^) hordozón kicsaptuk. A termékeket Millipore-szUrőre gyűjtöttük, 5%-os triklórecetsavval és 1 ml dimetilszulfoxid-etanol-0,1 mólos nátriumklorid (0,5:70:29, 5) keverékkel alaposan 35 átmostuk, szárítottuk és Packard-féle folyadékszcintilláciős számlálőkészUlékben 2 ml BBS3"ban (Beckman) és 10 ml liquifluorban (New England Nuclear) megszámláltuk. Azt találtuk, hogy 5-20jUg/ml koncentrációk szintetikus DNS-templáttal a leukae-40 miás polimerázt 50%-ban gátolják. A szintetikus RNS-templáttal (poli rA. rU) irányított reakció még érzékenyebb volt. Reprezentatív kísérletek, amelyeket természetes templáttal végeztünk normál- vagy tumor-sejt-45 polimerázon, azt mutatták, hogy a tumor-enzimek a vizsgált vegyületekre ilyenkor még érzékenyebbek. Az uj rifamicin-származékok más biológiai tulajdonságai: egér, patkány és ember sejtjeinél a 50 Moloney és Kirsten-féle egér-sarcoma-virustörzs által előidézett főkuszképződést gátolják; a már transzformált egér- és embersejtek virustermelését szelektíven gátolják; a visszafejlődő sejtek kimutatása, egér-sarcoma-virus által transzformált 55 nem-termelő egér és patkány sejtrendszereket használva. A találmány szerinti hidrazonvegyUletek ezenkívül igen szelektív toxicitástmutatnak virusok által transzformált egér-, patkány- és ember-sejteken, ha azokat kolóniaképző képességükre vizs-60 gáltuk. A vegyületek gátló hatását a Moloney sarcomavirusok által előidézett főkuszképződésre BALB/3T3 szövettenyészeten a következő módszerrel vizsgáltuk: 65 BALB/3T3 sejtkulturát tenyésztettünk 250 ml-es 4
