164927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-alkenil-rifamacin SV-származékok előállítására

5 16492 7 6 Hatanaka és társai: DNA-polymerase activityassociated with RNA tumor viruses [Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 143 (1970).] Scolnick és társai: DNA synthesis by RNA containing tum or viruses [Proc. Nat. Acad, Sei. USA, 67, 1034 (1970)]. Az RNS-virusoknak bizonyos tumorokban való jelenlétét más faktorok is alátámasztják: reverztranszkriptázokat találtak olyan asszonyok tejének részecskéiben, akiknekcsaládjában ímellrák fordult elő és akik a családon bellii házasodtak [Scholn és társai: Nature, 231, 97 (1971)]. Priori és társai [Nature, New Biology, 232, 16 (1971)] reverztranszkriptázt tartalmazó, ESP-1-nek elnevezett vírust izoláltak egy nyirokmirigy gyulladásban (Lymphadenitis) megbetegedett gyermek mellhártyafolyadékának sejtjeiből, amit szövetkulturán sikeresen tenyésztettek. Az egér RNS emlőtumor-virusával homológ RNS jelenlétét emberi mellráknál R. Axel és társai [Nature, 235, 32 (1972)] molekuláris hibridizációs kísérletekkel mutatták ki. Az emberi mellrák-virus lehetőségét az emberi tej elektronmikroszkópos vizsgálatával is alátámasztották [N. H. Sarkar és társai: Nature, 236, 103 (1972)]. RNS-fUggő DNS-polimerázaktivitást találtak és virushoz hasonló részecskéket izoláltak emberi rhabdomyosarcoma sejtekből [MC Allister és társai: Nature, New Biol. 235, 3 (19720. Jelenleg a virusos megbetegedések kezelésére igen hatásos gyógyszerek nincsenek, mivel a virus ok és sejtek anyagcserekövetelményei azonosak. A virális kemoterápiához vezető, legtöbbet igérő ut a megfelelő vegyszerek kialakítása, amelyek specifikus módon egyesülnek a virális vagy a vírusok által transzformált sejtpolimerázokkal, de nem egyesülnek a gazdasejtek polimerázaival, amelyek a vírusok genetikai információjának kifejezését kontrollálják. A virális vagy vírusok által transzformált sejtenzimek specifikus inhibitorai és főképpen az RNS tumorvirus-polimerázok inhibitorai jelentős szerepet játszhatnak a leukaemia és más rákos betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerek: készítésénél. A találmány szerinti vegyületek gátló hatását egér sarcoma vírusának RNS-fUggő DNS-polimerázán és tisztított enzimek DNS-f UggőDNS polimerázaktivitásán vizsgálták. A gátló hatást C. Gurbo és társai [Nature, New Biology, 220, 111 (1971)] által ismertetett módszerrel vizsgáltuk. A gyógyszerek különböző koncentrációinak a polimer áz-aktivitásra kifejtett hatását ugy határoztuk meg, hogy 3H-dTTP-nak (tríciummal jelzett timindezoxiribozidtrifoszfát) az oldhatatlan frakcióba történő beépülését követtük. A kísérleti műveleteket az alábbi jellegzetes példán mutatjuk be. A vírus izolálása és a virális polimeráz tisztítása A vírust a már említett módon[tGreen és társai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385-393 (1970); Rokutanda és társai: Nature, 227, 1026-1028(1970) _ izoláltuk és tisztítottuk egér sarcoma-virus (Moloney izolátum) által transzformált patkánysejtekből (78A1 sejtek) és egér sarcoma virus (Harvey-izolátum) által transzformált egérsejtekből (MEH sejtek). A virion-pollmerázt 20-40-szeresen tisztítottuk ugy, hogy a tisztított vírust 0, 5% NP-40 (nonidet P-40) (0,1 mólos NaCl-ben), 0,01 mólos trisz-5 puffer (pH = 7, 6) és 0, 001 mólos EDTA keverékében szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk és 15-30% szacharóz-gradiensben, 10 mmólos nátriumfoszfát-puffer (pH = 7,4) 2, 5 mmólos magnéziumklorid, 10 mmólos ditiotreit és 5% glicerin keveré-10 kében 24 órán át 38,000 ford./perc sebességgel, Spinco SW41 rotorban zónás centrifugálásnak vetettük alá. A 22 összegyűjtött frakcióból az enzimaktivltás csucsfrakcíólt (13-17) egyesítettük és -70°C on 30%-os glicerinben tároltuk. 15 DNS-polimeráz vizsgálata Az enzim inkubációját 1 órán át 3 rC-on végeztük 100 ml, 40 mmól trisz-puffert (pH = 8,0), 5 mmól ditiotreitet, 30 mmól nátriumkloridot, 2,5 20 mmól magnéziumkloridot, 0,1 mmól dezoxiadenozintrifoszfátot (dATP), dezoxicitozintrifoszfátot, (dGTP), dezoxicitozintrifoszfátot (dCTP) és lOpCi 3H-dTTP-ot (12-18 Ci/mmől) tartalmazó keverékben [Green és társai: Proc. Nat. Akad. Sei. USA, 25 67. 385-393(1970)]. A reakciót 150ju.1 1 n perklórsav hozzáadásával fejeztük be. Borjuthymusz-DNS-t (100 g) adtunk hozzá hordozóként, a radioaktiv DNS terméket a fent említett irodalom szerint kezeltük. Az endogén RNS-fUggő DNS-polimeráz- aktivitást 30 0,01% NP-40-nek a tisztított virushoz történő hozzáadása után a vizsgálat időpontjában mértük. A, tisztitott vírus-polimeráz DNS-polimeráz-aktivitását 2)jigpoli-d(A-T) templáttal, NP-40 nélkUl mértük. 35 Rifamicin-származékok gátló hatásainak vizsgálata A rifamicin-származékokat dimetilszulfoxidban 5 mg/ml koncentrációban oldottuk és 4°C-on tárol-40 tuk. Az endogén RNS-fUggő DNS-polimeráz aktivitását ugy vizsgáltuk, hogy dimetilszulfoxiddal megfelelően hígított 2 jxl rlfamicin-származékot vagy 2/j.l dimetilszulfoxidot (kontroll) adtunk a vizsgálandó keverékhez, mielőtt a 15-30;u.g virális pro-45 teint tartalmazó szétroncsolt virust hozzáadtuk. Az enzim inkubációját 37°C-on 60 percig végeztük. A tisztitott enzimgátló hatását ugy vizsgáltuk, hogy 2/LI rifamicin-származékot vagy dimetilszulfoxidot és 30yul enzimet (1-2 jug protein) 37°C-on 10 percig 50 előinkubáltunk, majd 70,u.l szubsztrátum-keveréket adtunk hozzá, a keveréket tovább inkubáltuk és a fent leírtak szerint kezeltük. Reprezentatív kísérletekben a találmány szerinti vegyületek 2-lOOjug/ml vagy ennél kisebb kon-55 centrációban a 3

H-dTTP beépülését 10%-nál kisebb értékre csökkentették, amint ezt a kontrollkisérletekkel megállapítottuk. A vegyületek tehát a legujabbbiokémiai megismerések szerint az RNS tumor-virusok által előidézett rákfejlődés mechaniz-60 musára nyilvánvalóan gátló hatást fejtenek ki. A reverz-transzkriptáz gátló hatását ugyancsak egér leukaemia-virus-polimerázán végzett vizsgálatokkal igazoltuk. Egér leukaemia-virus RNS-fUggő DNS-polimerázát preparáltuk Triton X 100-zal 65 szétroncsolt virionokból [Gallo és társai: Nature, 3