164880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amiláz és proteáz tartalmú fermentlé előállítására bacillus subtilis törzzsel való fermentációval
164880 kukoricáié kvart, szénforrásként 4-10 súly% tejsavóport alkalmazunk. Találmányunk előnyös foganatosítási módja szerint szénforrásként tejsavóport alkalmazunk. (A tejsavőpor 70-75% laktóz tartalom mellett tartalmazza a tej kisebb molakulasúlyú elemeit, fehérjéket, vitaminokat, sókat. Ezen terméket a tejsavó beszáritása útján nyerik.) A szénforrás koncentrációja 4-10 súly%, előnyösen 5,5-7,5 íúiy%. Találmányunk előnyös foganatosítási módja szerint szerves nitrogénforrásként 1,5-^2,5 súly% szójalisztet vagy kukoricalekvárt (komplex fehérje) alkalmazunk. A fermentációt rázott technológia szerint előnyösen 28 °C-on fermentorokban (kísérleti és üzemi szinten), 37 °C-on végezzük. 37 °C-on végezve a fermentációt a magas termelési érték mellett a fermentációs idő nagymértékben lerövidül. Az aamiláz aktiválási értékeket Smith-Roe módszerével határoztuk meg [Smith B. W., and Roe J. HL, J. biol. Chem 197, 53 (1949)] és a kapott eredményeket SKB egységre [Sanstedt, R. M., Kneen, E., and Bush,,' M.J. Cereal Chemistry 16, 712 (1939)] számoltuk át. A proteáz meghatározására a PUK módszert használtuk (Kaken Laboratórium módszere). Eszerint a következőképpen járunk el: Meghatározás menete: 1 rri 7,38*as foszfát pufferten hígított enzimoldatot 1 ml kazein oldathoz pipettázunk kémcsőben, majd 10 percig ultratermosztátban 40°C-on termosztátjuk. Ekkor 2 ml kicsapó reagenst adunk hozzá, majd 20 percig ultratermosztátban 40°C-on ismételten inkubáfiuk. Szűrünk, majd a szűrlet 1 ml-éhez 5 ml nátriumkarbonát oldatot és 1 ml Folin reagenst adunk, 20 percig 40 °C-on ultratermosztátban termosztáljuk. A „vak" elkészítéséhez 1 ml enzimoldathoz (a meghatározáshoz használt koncentrációban) 2 ml kicsapó reagenst adunk, 10 percig 40 °C-on ultratermosztáljuk, majd 1 ml kazein oldatot adunk hozzá, 20 percig 40 °C-on ultratermosztáljuk, szűrjük. A továbbiakban úgy járunk el, mint a meghatározásnál. A leolvasáshoz a következő „vak"-ot készítjük el: 1 ml pufferoldathoz 2 ml kicsapó reagenst adunk, szobahőmérsékleten összerázzuk, szűrjük, majd a szűrlet 1 ml-éhez 5 ml nátriumkarbonát oldatot és 1 ml Folin reagenst adunk. A meghatározásokhoz a következő reagenseket használtuk: pH 7,38-as foszfát puffer Sörrensen szerint, pH 7,38-as pufferral készített 2%-os kazein oldat, kicsapó reagens: 12,1 ml jégecetet, 16,4 g nátriumacetátot, 16,34 g triklórecetsavat desztillált vízben oldunk és 1 literre egészítjük ki. Nátriumkarbonát oldat: 42,1 g nátriumkarbonátot desztillált vízzel 1 literre feloldunk. Folin reagens: Folin O., Ciocalteu V., Journ. of biol. Chem 73, 627 (1927). A minták extinkció értékeit 660 nm-en olvassuk le Spektromom fotométeren. A számítást a következőképpen végezzük: Ferme ntlé aktivítás=HígításX (Eminta-Evak)* 4+ 4PUK/ml. A találmány szerinti eljárást a példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. Példák 1. A fermentációt a BS-IV/1963 jelzésű, MNG63 deponálási számú Bacillus subtilis törzzsel laboratóriumi üvegfermentorokban 37 °C-on végeztük. A 10 liter űrtartalmú üvegfermentorokba 6 liter táptalajt készítettünk be. A keverők fordulatszáma percenként 550-600 volt, a tenyészeteken percenként és táptalaj literenként 1 liter steril levegőt áramoltattunk át. Habzásgátlóként pálmaolajat használtunk. A fermentációs táptalajokat 10 térfogat% R-19 jelű inokulum táptalajon nőtt 24 órás vegetatív tenyészettel oltottuk be. Az inokulum táptalajt a BS-IV/1963 jelű, 63-as deponálási számú Bacillus subtilis törzs lO'/riil spórát tartalmazó spóraszuszpenziójával oltottuk be úgy, hogy az inokulum táptalaj ml-ként 104 spórát tartalmazzon (az agar tenyészetről fiziológiás konyhasó oldattal lemosott spóraszuszpenzió mélyfagyasztóban 1/2 évig eltartható). A kísérletekben felhasznált táptalajok jelzése és összetétele a következő volt: R-19 jelzésű inokulum táptalaj: Szójaliszt 1,2%, kukoricalekvár nedves 1,2%, kukoricaliszt 2,5%, nátriumklorid 0,36%, kalciumkarbonát 0,6%, pálmaolaj 0,5%, pH sterilezés előtt 7,2. Enzimtertnekskez használt alap-táptalaj: Diammóniumhidrogénfoszfát 2,0%, káliumklorid 0,15%, magnéziumszulfát H2 0 0,05%, kalciumklorid (vízmentes) 0,01%, kalciumkarbonát 0,1%, ferroazui fát 7H2 0 0,001%, pálmaolaj 0,5%, pH sterilezés előtt 7,2. BS-40 jelű táptalaj: alaptáptalaj +4,8% keményítő+1,0% szójaliszt, BS-40/1 jelű táptalaj: alaptáptalaj+7,0% tejsavópor+i,0% szójaliszt, BS-40/2 jelű táptalaj: alaptáptalaj+10,0% tejsavópor+1,0% szójaliszt, BS-40/3 jelű táptalaj: alaptáptalaj+4,8% tejsavópor+1,0% szójaliszt, BS-^8 jelű táptalaj: alaptáptalaj+4,8% keményítő +2,0% szójaliszt, BS-48/1 jelű táptalaj: alaptáptalaj+7,0% tejsavópor+2,0% szójaliszt, BS-48/2 jelű táptalaj: alaptáptalaj+10,0% tejsavópor+2,0% szójaliszt, BS-48/3 jelű táptalaj: alaptáptalaj+4,8% tejsavópor+2,0% szójaliszt, BS-214 jelű táptalaj: alaptáptalaj+5,54% laktóz+ +1,0% szójaliszt, BS-215 jelű táptalaj: alaptáptalaj+5,5% laktóz+ +2,0% szójaliszt. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
