164533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a tuberaktinomicin-N antibiotikum előállítására
7 164533 8 A találmány szerinti eljárásban elsősorban a fent jellemzett, FERM P-619 szám alatt deponált S. griseoverticillatus var. tuberacticus N6 130 törzset alkalmazzuk, mint a legelőnyösebb termelő törzset, meg kell azonban jegyezni, hogy felhasználhatók erre a célra más olyan, a fentivel lényegileg egyenértékű Streptomyces törzsek is, amelyek a leírthoz hasonló tulajdonságokat és hasonló képességet mutatnák a tuberaktinomicin-N antibiotikum termelésére. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitele során a tuberaktiomicin-N antibiotikumot termelő mikroorganizmusokat az antibiotikumok gyártásában szokásos módon tenyésztjük. Alkalmazhatunk szilárd vagy folyékony tápközegen történő fermentációt, az adott körülményektől függően. Előnyös azonban a termelést ipari méretekben folyékony tápközegen, szellőzött alámerülő kultúrában lefolytatni. Tápközegként az ilyen fermentációs eljárásokban szokásos közegek alkalmazhatók. Szénforrásul bármely asszimilálható szénvegyület szolgálhat, például dextróz, szacharóz, laktóz, maltóz, keményítő, dextrin, melasz, glicerin és hasonlók. Nitrogénforrásként ugyancsak az ismert és a fermentációs iparban használatos ilyen anyagok bármelyike felhasználható, például szójaliszt, kukoricalekvár, gyapotmagliszt, siker, pepton, húskivonat, élesztő vagy élesztőkivonat, kazein-hidrolizátum, ammóniumsók, nitrátok és hasonlók. Emellett a fermentációs közegekben szokásos sók, mint foszfátok, valamint különféle magnézium-, kálium-, nátrium-, cink-, vas- vagy mangánsók és hasonlók is alkalmazhatók a tápközegekben. A fermentációs hőmérséklet célszerűen 25-35 C° lehet, azonban e hőmérséklethatárok adott esetben túl is léphetők. A fermentáció időtartama —a fermentáció körülményeitől függően - általában 2—10 nap lehet, adott esetben azonban ezek a határok is módosulatok az adott körülményeknek megfelelően, a maximális antibiotikum-termelés biztosítása érdekében. Minthogy a tuberaktionomicin-N antibiotikum vízben könnyen oldódik, a vizes fermentléből csak igen nehezen extrahálható vízzel nem elegyedő szerves oldószerek segítségével. Ezért az ipari méretű termelésben az elválasztási és tisztítási műveleteket annak a tulajdonságnak a hasznosításával végezzük, hogy a tuberaktinomicin-N alkalikus jellegű anyag. Az új antibiotikumnak a fermentléből történő elválasztása ezért célszerűen olymódon történhet, hogy a mikroorganizmus-sejtek szűréssel történő elkülönítése után a szűrlethez valamely szulfonát-típusú színezék, mint eriokróm-ibolya, metiloránzs, „Pontanine fast orange , „Alizarin redS", „Synthracene blue", „Pontanine green", „Erio fast shianine" vagy hasonló kémiai szerkezetű más ismert szulfonát színezék megfelelő mennyiségét adjuk, így a tuberaktionomicin-N antibiotikum színezék-sóját képezzük, amely könnyen elkülöníthető. Az így elkülönített színezék-sót azután valamely szerves oldószerben, mint metanolban, acetonban vagy hasonlóban szuszpendáljuk és a trimetilamin valamely szervetlen savval képezett sóját, például trimetilamin-szulfátot vagy -hidrokloridot adunk e szuszpenzióhoz, amikoris a tuberaktinomicin-N antibiotikum a megfelelő szervetlen savval képezett só, tehát például szulfát vagy hidroklorid alakjában kiválik. Eljárhatunk azonban 5 olymódon is, hogy a kapott színezék-sóhoz közvetlenül valamely szervetlen savat, például kénsavat vagy sósavat adunk, amikoris a tuberaktinomicin-N megfelelő sója képződik és a felszabadított szulfonát-típusú színezék valamely 10 vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel történő extrakció útján eltávolítható a vizes közegből. A tuberaktinomicin-N fenti módon kapott szervetlen savas sójának vizes oldatához valamely vízzel elegyedő szerves oldószert, például metanolt 15 va gy acetont adunk, a tuberaktinomicin-N szervetlen savas sója kiválik az oldatból és ülepítéssel vagy szűréssel elkülöníthető. A tuberaktinomicin-N antibiotikum ipari mértékben történő gyártása során a fermentléből 20 történő elkülönítés másik előnyös módja kationcserélő gyanták alkalmazásán alapul. Ilyen esetekben a tuberaktinomicin-N antibiotikumot a gyantán történő adszorbeáltatás útján különítjük el a fermentlé szűrletéből, majd valamely alkalmas 25 közeggel, például híg vizes kénsav- vagy sósavoldattal eluáljuk a gyantáról. Történhet az eluálás híg alkalikus oldatokkal is, ebben az esetben az eluátum hatóanyagot tartalmazó frakcióit semlegesítjük, betöményítjük és valamely erre alkalmas 30 szerves oldószer, mint metanol vagy aceton hozzáadása útján, a fentebb ismertetett módon kicsapjuk a tuberaktinomicin-N szervetlen savval képezett sóját Egy további alkalmas módszer szerint a 35 fermentlé szűrletét dialízisnek, gél-szűrésnek vagy más hasonló, a nagymolekulájú szennyezések eltávolítására alkalmas műveletnek vetjük alá, majd savat adunk az oldathoz, betöményítjük és ugyancsak valamely vízzel elegyedő szerves oldó-40 szer, mint metanol vagy aceton hozzáadása útján csapjuk ki a tuberaktihomicin-N szervetlen savval képezett sóját. Az így kapott nyers tuberaktinomicin-N sót további tisztítás céljából vízben oldjuk, az 45 oldathoz valamely szerves oldószert, például metanolt, etanolt, acetont, dioxánt, tetrahidrofuránt, vagy hasonlókat, vagy ilyen oldószerek elegyét adjuk és így a hatóanyagot kicsapjuk az oldatból, ezt az átkristáryosítási műveletet a 50 szükséghez képest többször megismételhetjük. Egy másik alkalmas tisztítási mód szerint a nyers antibiotikumot oszlop-kromatográfiai tisztításnak vetjük alá, erre a célra valamely alkalmas adszorbens, például kationcserélő gyanta, szilika-55 gél, cellulózpor vagy hasonlók használhatók. A tiszta tuberaktinomicin-N antibiotikumot tartalmazó frakciókat azután elkülönítjük, betöményítjük és az antibiotikumot só alakjában, a fentebb ismertetett módon leválasztjuk. 60 Egy ugyancsak ajánlható tisztítási mód a következő: a tuberaktinomicin-N sójának viszonylag tömény vizes oldatához trietilamin-szulfát vizes oldatának feleslegét adjuk, amikoris a tuberaktinomicin-N antibiotikum szulfátja képződik, a 65 szulfát így kapott oldatához azután valamely 4
