164431. lajstromszámú szabadalom • Eljárás noretiszteron származékok előállítására mikrobiológiai úton
164431 20 30 a d) el jár ás változat esetében. ab = ^CH=OH—, Rí = OH, R 2 = H—. Az eljárás abban áll, hogy a) Rhizopus arrhizus (MNG 86), vagy Sclero- 5 tinia sclerotiorum (MNG 83), vagy Curvularia lunata ,(MNG 80), vagy Absidia orchidis (MNG 13), vagy Cladosporium herbarum (MNG 84), vagy Mycogone rosea (MNG 85) törzsekkel a Í7^-hidroxi-17a-etinil-ösztr-4-én-3-ont 10/3,17,^- 10 -dihidroxi-17a-etinil-ösztr-4-én-3-onná alakítj uk át, vagy b) Fusarium lateritium (MNG 81) törzzsel a 17/?-Jiidroxi-l 7w-etinil-ösztr-4-én-3-ont 6ß, 17i/3-díhidroxi-17a-etinil-ösztr-4^én-3-onná alakítjuk át, i5 vagy c) Cephalosporium asperum (MNG 82) törzszsel a 17yff-hidroxi-17lcc-etinil-ösztr-4-én-3-ont §ß,lQß, 17/?-trihidroxi-l 7a-etinil-ösztr-4-én-3-onná alakítjuk át, vagy d) Arthrobacter simplex (MNG 66) törzzsel a 10/?, 17^-dihidr oxi-17a-etinil-ösztr-4-én-3-ont 10ß, 17—dihidroxi-17a-etinil-ösztra-l ,4-dién-3-onná alakítjuk át, és az átalakítási termékeket a fermentléből is- 5 mert módszerekkel elkülönítjük. A mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló táptalajok szénforrásként keményítőt, dextrint, szacharózt, glükózt, maltózt, glicerint, szójabablisztet, kukoricalekvárt, malátakivonatot tartalmazhatnak. Nitrogénforrásul a fent már említett nitrogént is tartalmazó anyagokon kívül kazeint, peptont, élesztőkivonatot alkalmazhatunk. A táptalajokat szervetlen sókkal egészítjük ki. A nitrogénforrás helyes megválasztásával a növesztést követő átalakítás sebességét befolyásolhatjuk. A mikroorganizmusokat süllyesztett, levegőztetett körülmények között, a gombákat 24—30 C° hőmérsékleten, a baktériumokat 37 C°-on növesztjük, és azonos körülményeket választunk az átalakításhoz is. A zll-dehidragenáz aktivitás fokozása érdeké- _ ben az Arthrobacter simplex tenyészetben az induktív enzim képződést zí4-3-ketoszerkezetü szteroidokkal, előnyösen hidrokortizonnal való előzetes inkubálással segítjük elő. A mikrobiológiai úton kapott átalakítási ter- 50 mékeket vízzel nem elegyedő, poláros oldószerrel, előnyösen etilacetáttal végzett extrakcióval nyerjük ki a fermentléből. Az átalakítási termékeket az extraktum bepárlási maradékából közvetlenül vagy pfeparatív vékonyrétegkroma- 55 tográfiás tisztítás után kristályosítással különítjük el. A preparatív vékonyrétegkromatográfiás tisztításnál szilikagél tartalmú adszorbenst, előnyösen Kieselgel G (Reanal) és Kieselgel HF254+366 (Merck) adszorbenseknek 2 : 1 arányú 60 keverékét alkalmazzuk a réteg készítésére. A mikrobiológiai úton előállított noretiszteron származékok szerkezetét az alábbiakban leírt vizsgálatokkal állapítottuk meg. A fermentációs úton kapott IQ/J-hidroxi-nore- 65 40 tiszteron a lQ/?-hidroxi-zí4-3-keto-szteroidokra jellemző módon [R. Y. Kirdani és munkatársa: J. Med. iChem. 7, 592, (1964)] sósavas metanol hatására 17fa-etin;il-ösztra-l,3,5(10)-trién-3,17/J-diol-3-metiléterré rendeződik át, és fizikai állandóit, valamint spektroszkópiai adatait illetően egyezést mutat a korábban szintetikus úton előállított vegyülettel [J. P. Ruelas és munkatársai: J. Org. Chem. 23, 1744, (1958), E. L. Shapiro és munkatársai: Tetrahedron Letters 663, (1964)]. A lQ'/?,17/?-dihidroxi-17a-etinil-ösztra-l,4-dién-3-on szerkezetét igazolja a vegyület infravörös színképében 1665 cm_1 -nél megjelenő vC=0 sáv, az 1615 és 1605 cm_1 -nél talált intenzív vC=0 sávok, a vegyület .mágneses magrezonancia spektrumában az A-gyűrűben levő olefin-protonok jeleinek a zll,4-3-keto-szerkezetre jellemző AMX-típusú felhasadása, valamint, hogy a vegyület tömegspektruma szerint a 10!/?-hidroxinoretiszteronnál két hidrogénnel kevesebbet tartalmaz (molekulaion csúcs: m/e = 312). A 6/?-hidroxi-noretiszteron szerkezetét bizonyítja, hogy belőle Jones szerint [J. Chem. Soc. 39, (1946)] kénsavas krómsavval acetonos közegben végzett oxidációval 17'/?-hidroxi-17icc-etinil-ösztr-4-én-3,6-dion (6-keto-noretiszteron) állítható elő. Az oxidációs termék zl4-3,6-diketo-szerkezetére jellemzően 253 m/^-nál mutat ultraibolya elnyelési maximumot; az infravörös spektrumában jelentkező "C=0 sávok (1692 és 1672 cm-1 ) arra utalnak, hogy a vegyület mindkét ketoncsoportja konjugációban van a z(4-es kettős kötéssel. Az oxidációs termék tömegspektrumában a molekulaion csúcson (m/e = = 312) kívül intenzív csúcsot ad a J4-3,6-diketo-szteroidokra jellemző módon [C. Djerassi és munkatársai: Steroids 6, 1, (1965)] az A-gyűrűt és a 6-os karbonilcsoportot magába foglaló fragmentum is (m/e = 123). A 6/?-hidroxi-noretiszteron a 6-hidroxi-zl4-3--keto-szerkezetű szteroidokra jellemző módon [B. Ellis és munkatársa: J. Chem. Soc. 1978, (1939)] sósavas etanolban melegítve 17^-hidroxi-17iCE-*etinil-ösztrén-3,6-dionná rendezhető át. Az átrendezett termék már nem mutatja a A4--4-keto-szteroidokra jellemző ultraibolya abszorbciót, infravörös színképében két telített 6-o,s gyűrű ketonra jellemző vC=0 sáv jelentkezik (1710 és 1703 cm-1), molekulasúlya ugyanakkor azonos (molekulaion-csúcs: m/e = 314) a 6/?-hidroxi-noretiszteronéval. A 6/J-hidroxi-noretiszteron mikrobiológiai úton beépült hidroxilcsoportjának térállását a vegyület mágneses magrezonancia spektrumából állapítottuk meg. A 6-os hidroxilcsoport geminális protonja, jelszélessége alapján (9 Hz), ekvatoriálisnak bizonyult. Így a hidroxilcsoport axiális kell, hogy legyen, a 6-os szénatomon levő axiális szubsztituens viszont ^S-helyzetű. A S.ßMß, 17i/?-trihidroxi-l 7ec-etinil-ösztr-4-én-3--on szerkezetét mikrobiológiai úton igazoltuk. Ezt a kétszeresen hidroxilezett noretiszteron származékot akkor is felhalmozza a Cephalo-2
