164378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális eredetű enzimfehérjék kinyerésére fermentlevekből, szelektív frakcionált dúsítással

164378 5 6 nálásánál különösen fontos szerepe van (tejalvasztó enzim). Eljárásunkkal bakteriális proteázra 87,3%-os kitermelést értünk el, ugyanakkor a 7833/41. sz. japán szabadalmi leírás szerint proteázra a kitermelés 75%. Az eljárásunkkal előállított, 3 hónapig stabil alkalikus proteáz lé 500 mAE/ml aktivitású sűrítmény formájában közvetlenül ipari célokra alkalmazható. A találmány szerinti eljárással egy adott üzem feldolgozási kapacitása megkétszereződik, mivel csak minden második fermentációt kell végig feldolgozni. Pl. rennin esetében feleannyi idő alatt lehet készterméket előállítani, mint Krueger W. eljárása szerint [Nahrung 1968. 12 (2). 149—55]. Ugyanakkor 10O00 U/ml aktivitású lé formájában a rennin közvetlenül alkalmazható sajtgyártásra a NOVO Rennilase-hoz hasonlóan. További előnyként jelentkezik, hogy az eljárással nyert nagyobb fajlagos akivitású enzimek gyógyászati és analitikai célokra közvetlenül alkalmasak. A találmány szerinti eljárást, illetve annak gyakorlati kivitelezési módját az alábbi példaként ismertetett leírásokban mutatjuk be, amelyek azonban nem tekinthetők korlátozó jellegűnek. 1. példa: A Bacillus sübtilis var. proteolyticus (OKI deponálási sz. 54/69.) törzset megfelelő táptalaj komponensekkel süllyesztett fermentációnak vetjük alá és 40 óra után 40,4 mAE/ml aktivitású fermentlevet kapunk. [Meghatározás: Anson M. L.: J. Gen. Physiol., 22. 79. (1938)]. Ennek a fermentlének 1 literét pH = 6,0-ra állítjuk be és 0,5% tannint adunk hozzá 10%-os oldat formájában, szobahőfokon. 2 órai állás után a csapadékot szűréssel, vagy oentrifugálással elválasztjuk a létől. A keletkezett nedves enzim-tannin komplex 30 g és 1,35 AE/g aktivitású, míg a kitermelés 100%-os. Az enzim-^tannin komplexet 1 liter 0,05 m pH = 9,0 borát puffert tartalmazó 40,4 mAE/ml aktivitású fermentlébe adagoljuk és 4 órán át kevertetjük szobahőfokon, majd 0,2% cetil-piridinium-bromidot (Sterogenol) adunk hozzá 10-%-os oldat formájában. 1 órát állni hagyjuk és a csapadékot szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk a létől. A 900 ml tükrös éles lé az összes enzismaktivitás 92%-át tartalmazza. A 900 ml tükrös éles levet filmbepárlón eredeti térfogatának ötöd részére bepároljuk. Keletkezik 180 ml 410 mAE/ml aktivitású éles lé 91,6%-os kihozatallal. A proeázt lé formában használjuk fel. 2. példa: Megegyezik az 1. példa kivitelezésével, de a filmbepárlón ötszörösére bepárolt levet 108 g ammónium-szulfáttal kezeljük +5 C°-on pH = ;= 9,0 értéken és kinyerjük az alkalikus proteáz enzimet. Keletkezik 14 g 5,0 AE/g aktivitású termék 87%-os kitermeléssel. 3. példa: Megegyezik az 1. példa kivitelezésével, de a filmlbepárlón bepárolt levet 2 térfogat 0 C°-os metanollal kezeljük. A kivált enzimet elválasztjuk a létől. Keletkezik 12 g 5,0 AE/g aktivitású termék 74,4%-os kitermeléssel. 4. példa: Megegyezik az 1. példa kivitelezésével, de a filmbepárlón bepárolt levet porlasztva szárítjuk. Keletkezik 23 g 3,0 AE/g aktivitású termék 83,5%-os kitermeléssel. 5. példa: Megegyezik az 1. példa kivitelezésével, de a filmbepárlón bepárolt levet liofilizáljuk. Keletkezik 23 g 3,19 AE/g aktivitású termék 90,7%os kitermeléssel. 6. példa: Megegyezik az 1. példa kivitelezésével, de a 900 ml tükrös éles eredeti levet 540 g ammónium-szulfáttal pH = 9,0-en, +5 C°-on kisózzuk. Keletkezik 23 g 3,0 AE/g aktivitású termék 87,5%-os kitermeléssel. 7. példa: A Bacillus sübtilis var. proteolyticus (OKI deponálási száma 54/69) törzset megfelelő táptalaj komponensekkel süllyesztett fermentációnak vetjük alá és 38 óra után 45 mAE/ml aktivitású fermentlevet kapunkj Ennek a fermentlének 1 literét pH •= 9,0-re állítjuk be és 600 g ammónium-szulfátot adunk hozzá szebahőfokon. 10 órai állás után a csapadékot szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk a fenmentlétől. Keletkezik 6,5 g nedves csapadék 0,65 AE/g aktivitással, 94%,-os kitermeléssel. A nyers enzimcsapadékot a következő fermentáció 1000 ml fermentlevébe oldjuk be. A fermentlé 34 órás 53 mAE/ml aktivitású, a pH-ja = 9,0. 1 órai kevertetés után 0,1%, eetil-piridmium-bromidot adunk 10%-os oldat formájában. További 1 órai állás után 5,55 g kalciumnkloridot és 3,55 g dinátrium-hidrogén-foszfátot és 1,5% P—3-as perlitet adunk hozzá és szűrjük a szuszpenziót. Az éles szűrtlé térfogata 900 ml, az összes aktivitás 92%-át tartalmazza. Az oldatot eredeti térfogatának egytizedére bepároljuk. Keletkezik 90 ml 890 AE/ml aktivitású lé, az összes aktivitás 81,6%-a. A 90 ml besűrített levet pH = 9,0-en és +5 C°-on 54 g ammónium-szulfáttal kisózunk. Keletkezik 20 g 4,0 AE/g aktivitású tennék 81,6 %,-os kitermeléssel. 10 15 20 26 30 35 40 45 50 55 0 3