164371. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein, valamint a kallikrein A és B komponenseinek tisztítására és kristályosítására
5 más, antigénként ható fehérjétől, valamint lázkeltő anyagoktól. A fentiek alapján a találmány eljárás kallikrein, valamint kromatográfiás úton a kallikrein A és B komponenseinek tisztítására és kristályosítására hasnyálmirigyből ismert módon fémsókkal végzett kicsapás útján kapott csapadékból. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a csapadékot eluáljuk, a kapott eluátumot sómentesítjük, bázikusan szubsztituált makropórusos ioncserélőn, célszerűen dietil-amino-etil-cellulózon vagy dietil-amino-etil-csoportokat tartalmazó térhálósított dextránon kromatografáljuk. savasán szubsztituált ioncserélővel, célszerűen karboxi-metil- vagy szulfo-etil-csoportokat tartalmazó térhálósított dextránnal kezeljük, majd a nagy tisztaságú kallikreint a kapott oldatból kicsapószer, célszerűen ammónium-szulfát adagolása útján kikristályosítjuk, illetve adott esetben a nagytisztaságú kallikrein oldatát önmagában ismert módon makropórusos anioncserélőn, célszerűen dietil-amino-etil-cellulózon vagy dietil-ammo-etil-csoportokat tartalmazó térhálósított dextránon végzett kromatografálással szétválasztjuk, és az így elválasztott komponenseket oldatukból kicsapószer, célszerűen ammónium^szulfát adagolása útján kikristályosítjuk. A találmány szerinti eljárás kiindulási anyaga emlősök hasnyálmirigyéből, előnyösen sertés hasnyálmirigyéből a 910 580 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett módon előállított eluátum. A kallikrein enzimaktivitásának meghatározását az N-benzoil-1-arginin-etilészter hidrolízisének mérése útján (Werle, E. és Kaufmann— Bretsch, B.: Naturwissenschaften 46, 559 1959) az F.I.P. (Federation Internationale Pharmaceutique) által szabványosított kiviteli formában titrimetrikus vizsgálatként (J. mond. Pharm., 1972. évi publikáció) végezzük. Az enzim-egységek átszámítását kutyák vérnyomáscsökkenésének mérése útján meghatározott biológiai kallikrein-egységekké (KE) (lásd Frey, E.; Kraut, H. és Werle, E.: Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke kiadóvállalat, Stuttgart 1968, 11. oldal) az alábbi egyenlet alapján végezzük: 1 KE = 6,37 F.I.P. (enzim)-egység. A tiszta kallikrein oldatának 'fehérjetartalmát a 280 nm-en mérhető extinkcióból határozzuk meg, amikoris extinkciós> koefficiensként E JSO = 19>3 (kallikrein 1'%-os oldatának pH 7 értéken mért extinkciója) értéket veszünk. Azt találtuk továbbá, hogy a 910 580 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett módon előállított eluátum sótalanítása dialízis vagy gélszűrés útján végezhető. Az ezt követő, makropórusos anioncserélőkkel végzett kromatografálás során a találmány értelmében különösen bázikusan helyettesített cellulózokat vagy kielégítő pórusnagyságú bázikusan szubsztituált géleket használunk. '6 Előnyösnek bizonyul, ha ezt a tisztítási lépést DEAE-Sephadex márkanevű anyaggal töltött oszlopon végezzük. Az adszorpció számára kedvező pH 4,0 és 8,0 között előnyösen pH 4,5—5. 5 Az eluálás végezhető állandó pH értéken növekvő sókoncentrációval, vagy állandó sókoncentráció esetén a pH érték csökkentésével, vagy a kétféle eljárás kombinálásával. A pH értékének és a sókoncentrációnak a változása történ-10 het folyamatosan gradiens-eluálásként vagy fokozatosan. Az eluáláshoz bármely ismert puffersó használható; előnyösnek bizonyulnak az illékony puffereók, így például az lammóniumformiát, ammónium-acetát, ammónium-propio-15 nát vagy a megfelelő alkilammóniumsók, így a trietilammónium-formiát. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja értelmében a kallikreint 0,2 mólos ammónium-acetátoldatból pH 5,0 értéken DEAE-Sephadexből ké-20 szült oszlopon adszorbeáltatjuk, az inaktív fehérjét pH 5,0 értékű 0,25 mólos ammónium-acetáttal kimossuk, és végül a feldúsított kallikreint pH 4,5 értékű 0,3 .mólos ammóniumacetáttal eluáljuk. 25 A makroporósus anioncserélőkkel végzett kromatografálás lényegesen kedvezőbb az 1 102 973 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett módszernél, minthogy ezáltal a termelési hányad és a kivitelez-30 hetőség egyszerűsége technikai szempontból nézve döntő mértékben jobb. Az így feldúsított kallikreint a találmány értelmében makropórusos kationcserélővel végzett kezeléssel tovább tisztítjuk. így mintegy 90%-os 35 tisztaságú készítmények állíthatók elő. Makropórusos .kationcserélőként különösen savasán szubsztituált cellulózok vagy kielégítő pórusnagyságú savasán szubsztituált gélek, így például térhálósított dextrán vagy poliakrilamid 40 használható. A feldúsított kallikrein oldatának kationcserélővel végzett kezelését úgy foganatosítjuk, hogy az oldatot a kationcserélővel keverjük, vagy az oldatot kationcserélő-rétegen vezetjük keresztül. Amennyiben oszlopot hasz-45 nálunk, célszerűnek bizonyul, ha az előző tisztítási lépésben kapott kallikrein-oldatot betöményítjük, és sótalanítjuk. A keverés vagy a szűrés során a gélek szennyezőanyagokat tartanak vissza, míg a kallikrein akadály nélkül halad át a szűrőrétegen. A szűréshez vagy a keveréshez használt makropórusos kationcserélőket ismert módon előzetes kezelésnek vetjük alá. Szűréshez hígított pufferoldatokkal a kationoserélőket elkeverjük, 55 majd például oszlopokba beiszapoljuk az így kapott anyagokat. Az oszlophossz és az oszlopátmérő viszonya a szűrési folyamat szempontjából másodlagos jelentőséggel bír. Előnyösnek bizonyul, ha az oszlopátmérő nagy. A pufferoldatok elkészítéséhez önmagában ismert puffersókat, de különösen illékony puffersókat, így például ammónium-formiátot, ammónium-acetátot, ammónium-propionátot, vagy a megfelelő alkilammóniumsókat, így például trietilammó-65 nium-formiátot használunk. A pufferoldatok pH 3
