164371. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein, valamint a kallikrein A és B komponenseinek tisztítására és kristályosítására

164371 7 8 értékét 4,5 és 8,5, előnyösen 5,0 és 7,0 közé állítjuk be. Kristályos kallikrein előállítására a nagytisztaságú kallikreint szilárd vagy koncentrált oldatként alkalmazott arnmónium-szulfát adagolása útján pH 4,0 és pH 8,0 közötti pH értéken kikristályosítjuk. A kikristályosodás mintegy 45% ammónium-szulíáttal való telítettség esetén néhány napon belül végbemegy, előnyösen 15 C° és 25 C° közötti hőmérsékleten. A kristályok vékony tűkristályok, melyek nyalábokká állnak össze. A kristályok az anyalúgtól centrifugálás vagy szűrés útján különíthetők el, majd 50%-os telített, ammónium-szulfát-oldattal mossuk, és hígított sóoldatokban vagy vízben oldjuk őket. A kristályok tiszta kallikreinből állnak. A mintegy 1600 KE/mg fehérje értékű fajlagos aktivitás többszöri átkristályosítás hatására sem nő. Az adott esetben kristályos kallikrein-komponensek előállítására a tisztított kallikreint ismert módon DEAE-oellulózzal vagy DEAE-Sephadex márkanevű anyaggal végzett kromatografálás útján kallikrein A és kallikrein B komponensekre választjuk szét. A komponensek elválasztása azonban végezhető a tisztítási eljárás egy korábbi lépése során is. Ez esetben az elválasztott komponenseket külön-külön továbbtisztítjuk. A nagytisztaságú kallikrein-nkomponenseket a találmány értelmében külön-külön szilárd vagy koncentrált oldatként alkalmazott ammónium-szulfát adagolása útján pH 4,0 és pH 8,0 között kristályosítjuk ki. A kikristályosodás 45%os ammónium-szulfáttal való telítettség mellett néhány nap alatt végbe megy, előnyösen 15 C° és 25 C° közötti hőmérsékleten. A kristályok vékony tűkristályok, amelyek hasábokká állnak össze. A kristályok az anyalúgtól centrifugálás vagy szűrés útján különíthetők el, majd 50%ban telített ammónium-szulfát-oldattal mossuk őket. Hígított sóoldatokban vagy vízben oldhatók. A kristályok tiszta, elektraforetikusan egységes kallikrein A, illetve kallikrein B komponensekből állnak. Az 1. ábra egy elektroforézis eredményeit mutatja be. 8,6 pH értékű veronal-Na-pufferrel dolgoztunk. Az ionerősség értéke 0,075, a feszültség 100 V, a futtatási idő 20 perc volt. 0 időpontban a szaggatott vonal magasságában vittük fel a vizsgálni kívánt vegyületeket. Az 1 pontban kallikreint, a 2 pontban kallikrein A komponenst, míg a 3 pontban kallikrein B komponenst vittünk fel. A mintegy 1600 KE/mg értékű fajlagos aktivitás többszöri átkristályosítás során sem nő. A találmány szerinti eljárás során a részben tisztított kallikrein elkülöníthető szennyező anyagaitól, és más enzimektől felettébb egyszerű módon, körülményes eluálási módszerek használata nélkül. Nem volt várható, hogy a szennyező anyagokat és más enzimeket a makropórusos kationcserélők megkötik, míg a kaidikreint nem, és így az oldatban maradt kallikrein a találmány szerinti eljárás során nagy tisztasággal és igen magas termelési hányaddal állítható elő. A kallikrein A komponens és kallikrein B komponens kristályosítása útján az egyébként igen nehezen elválasztható lázkeltő anyagok majdnem teljesen elkülöníthetők. A ta-5 lálmány szerinti eljárás egyszerűsége lehetővé teszi annak technikai megvalósítását. Ezáltal a találmány szerinti eljárás hozzájárul a technikai ismeretek bővüléséhez. A kallikrein, illetve a kallikrein-komponensek kristályainak oldata azonosítható pH 7 értéken felvett ultraibolyaspektrum útján, amikoris 282 nm-nél maximum, 251 nm-nél minimum, továbbá 277 és 290 nm-nél két váll észlelhető, míg a 280 nm-nél és a 260 nm-nél mérhető extinkciók viszonya 1,78 (lásd a 2. ábrát, folyamatos vonal). 0,1 n nátriumhidroxid-oldatban az ultraibolya spektrum 280 nm-nél és 289 nm-nél .maximumokat mutat (lásd a 2. ábrát, szaggatott vonal). A találmány szerinti eljárással előállított kallikrein, valamint a kallikrein A komponens és a kallikrein B komponens gyógyszerek hatóanyagaként hasznosítható. Értágító hatásuk következtében ismert módon a kallikreint tartalmazó gyógyszerek különösen helyi vérkeringési zavarok, így például endangiitis obliterans, arteriosclerosis obliterans, morbus Raynaud, továbbá rendellenes csonttörési és sebes gyógyulások esetén, így például a Sudeck-szindróma esetén, égési sérülések, valamint öregkori keringési zavarok esetén alkalmazhatók sikerrel. A felhasználás történhet orálisan olyan tabletták vagy drazsék formájában, melyek a kristályos kallikreint vagy komponenseit inert, nem toxikus, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokkal összekeverve tartalmazzák. Másrészt a felhasználás történhet par enter álisan a kristályos kallikrein vagy komponensei vizes oldatából álló intramuszkuláris vagy intravénás injekció formájában. Különösen parenterális, alkalmazás esetén a kristályos kallikrein nagy előnye a korábban alkalmazott, kevésbé tiszta készítményekkel szemben az, hogy kisebb a nem kívánt mellékhatások és allergiás reagálások veszélye. A 941 685 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett nagymolekulájú kolloidok, így például dextrán vagy polivinilpirrolidon adagolása vagy az 1 000 566 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett Trasylol márkanevű kallikrein-inhibitorral végzett komplexképzés útján a kristályos kallikreinből nyújtott hatású injekciós készítmények állíthatók elő. Kallikrein injekciós célokra előállítható továbbá izotóniás oldatként vagy a kristályos kallikrein komponensei alkalmas hordozóanyaggal, így például dextránnal, mamuttal, laktózzal, vagy zselatinnal alkotott keverékeinek fagyasztásos szárítása útján kapott szilárd anyagként, amikoris az utóbbi esetben alkalmas oldószerrel végzett oldás útján a felhasználásra kész oldat közvetlenül a felhasználás előtt elkészíthető. A találmányt közelebbről az alábbi példával világítjuk meg. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4