164371. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein, valamint a kallikrein A és B komponenseinek tisztítására és kristályosítására

164371 .4 tett cellulózt elválasztják, és a hatástalan kísérőanyagokat erősen hígított pufferoldattal kimossák. A hatóanyag ezt követően a bázikusan helyettesített cellulózról 1—5%-os elektrolitoldattal deszorbeálható. Így körülbelül 50—100 KE/mg fehérje aktivitású készítmények állíthatók elő (KE = kallikrein-egység, meghatározása kutyák vérnyomáscsökkenésének mérésével történik, lásd Frey, E.; Kraut, H. és Werle, E.: Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Enke kiadóvállalat, Stuttgart, 1968, 11. oldal). Még nem tisztított kallikrein^készítmények tovább tisztíthatók az 1 124 187 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint is. Ezen eljárás során a kalhkrein-készítményt kicserélőmembránok használata mellett elektrodialízisnek vetik alá. Így 50 KE/mg aktivitású készítmények állíthatók elő. A kallikrein adszorbeáltatását DEAE-cellulózon a Karboxipeptidáz B tisztítására szolgáló eljárásban (1 642 614 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli közzétételi irat, illetve, Chem. Abstr., 73, 116749n) is alkalmazzák. A kallikrein elkülönítését azonban nem ismertetik. Az így tisztított kallikrein-készítmények csak részben alkalmasak parenterális alkalmazásra. Egyrészt más fehérjetartalmuk következtében immunológiai érzékenységet okozhatnak, és többszöri alkalmazás esetén életveszélyes anafilaxiás sokkot idézhetnek elő. Másrészt az eddig ismert tisztítási eljárásokkal meglehetősen bonyolult volt olyan készítményeket előállítani, melyek megfelelően kis mennyiségben tartalmaznak lázkeltő anyagokat. Ugyanakkor lehetetlen volt a lázkeltő .anyagokat derítő- vagy steril szűrőrétegekkel végzett szűréssel elkülöníteni, minthogy a kallikreint az említett anyagok nagymértékben adszorbeálják. Ismeretes továbbá, hogy nagytisztaságú kallikrein kis mennyiségben különböző eljárások szerint előállítható. A Fritz, H. és társai által ismertetett módon [Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 348, 1120—1132 (1967)] előállítható egy 1516 KE/mg fehérje fajlagos aktivitású készítmény, ha a 910 580 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett .módon előtisztított készítményt egyszer, kétszer vagy háromszor hidroxilapatit-cellulózon kromatograf alják. Ez esetben azonban elkerülhetetlen, hogy az eluáló puffer optimális koncentrációját minden egyes kallikrein-minta és minden egyes új hidroxilapatit-cellulóz bemérés esetén előzetes kísérletekben meghatározzák. Ez a módszer így eljárástechnikai szempontból megvalósíthatatlan. Más javaslat szerint {Moriya, H. és társai, Biochem. Pharmacol. 18, 549—552 (1968)] elektroforetiku'San tiszta kallikrein 6—9%-os termelési hányaddal előállítható, ha az automatizált hasnyálmirigy-pépet DEAE-oellulózzal kezelik, 2-etoxi-6,9-diamino^akridiniumla.ktáttal kicsapatják, a kapott csapadékot ammónium-szulfátoldattal extrahálják, az extraktumból acetonnal csapadékot választanak le, majd a csapadékot hidroxilapatiton, majd Sephadex G 100 márkanevű (gyártó cég: Uppsala Fine Chemicals, Svédország) anyagon kromatografálják. Ez az eljárás is azonban az alacsony termelési hányad 5 és a nagyszámú reakciólépés következtében gyakorlatilag és technikailag megvalósíthatatlan. Az előbbiekben ismertetett eljárás során előállított kallikrein két izoenzim elegye. Elektroforézis vagy .anioncserélőkkel végzett kromatog-10 rafálás útján a kallikrein két komponensre, éspedig a kallikrein A komponensre és kallikrein B komponensre választható szét (Habermann, E.: Hoppe—Seyler's Z. Physiol, Chemie 328, 15—,23; Fiedler, F.: Hoppe—Seyler's Z. Physiol, 15 Chemie 348, 1097—1089 1967). Nem ismeretes azonban, hogy a két komponens között mutatkozó szerkezeti különbség a kallikrein glükofehérje aminosavszekvenciájának vagy szénhidrátrészének különbözőségében rejlik. A két kom-20 ponens biológiai hatékonysága nem tér el egymástól. Kristályos kallikreint, valamint kristályos kallikrein A és B komponenseket ezidáig nem állítottak még elő. 25 Azt találtuk, hogy tiszta kallikrein állítható elő, ha a 910 580 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett módon az ón- vagy cinksákkal végzett kicsapatás során kapott csapadékból előállított eluátu-30 mot sótalanítjuk, a sótalanított oldatot alkalmas makropórus anioncserélőn, így például DEAE-cellulózon vagy DEAE-Sephadex márkanevű anyagon kromatograf áljuk, a részben tisztított kallikrein így kapott oldatát alkalmas 35 makropórusos kationcserélővel, így például CHSephadex vagy SE-Sephadex márkanevű anyagokkal kezeljük, és adott esetben a kallikreint kristályosítjuk. Az így kapott kristályos kallikrein fajlagos aktivitása felülmúlja bármely ed-40 dig ismert készítmény fajlagos .aktivitását, és mentes más .antigénként ható fehérjéktől, valamint lázkeltő anyagoktól. Azt találtuk továbbá, hogy tiszta kallikrein A és B komponensek állíthatók elő, ha a 910 580 45 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett módon az ón- vagy cinksókkal végzett kicsapatás során kapott csapadékból előállított eluátumot sótalanítjuk, a sótalanított oldatot alkalmas makropórusos anion-50 cserélőn, így például DEAE-cellulózon vagy DEAE-Sephadex márkanevű anyagon kromatograf áljuk, a részben tisztított kallikrein így kapott oldatát alkalmas makropórusos kationcserélővel, így például CH-Sephadex vagy SE-Se-55 phadex márkanevű anyagokkal kezeljük, majd a kallikreint önmagában ismert módon makropórusos anionoserélőn, célszerűen dietil-amino-etil-cellulózon vagy dietil-amino-etil-csoportokat tartalmazó dextránon végzett kromatograf á-60 lássál kallikrein A és B komponensekre választjuk szét, és a kapott komponenseket ammónium-szulfát adagolása útján kristályosítjuk. Az így kapott kallikrein komponensek fajlagos aktivitása meghaladja bármely eddig ismert készít-65 meny fajlagos aktivitását, és biztosan mentes 2