164311. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 23 671 RP és 23 672 RP antibiotikumok előállítására
15 164311 16 laktalbumin, siker és hidrolizátumai, szójababliszt, földimogyoróliszt, halliszt, húskivonat, élesztőkivonat, szeszmoslék és kukoricalekvár (az utóbbi négy céBzerűea bepárólva, szárazanyag alakjában). A szervetlen, adalékok közül egyesek pufferoló 5 vagy közömbösítő hatásúak, mint például az alkáli- vagy alkáliföldfémfoszfátok vagy a kalciumkarbonát és a magnéziumkarbonát. Mások létrehozzák a Streptomyces chryseus DS 12 370 törzs fejlődéséhez és 23 671 RP és 10 23 672 RE termeléséhez szükséges ionegyensúlyt, ilyenek például*az "alkali- és. alkáliföldfémkloridok és -szulfátok.. Végül mások aktiválják a Streptomyces chryseus anyagcserereakcióit, ilyenek a cink-, kobalt-, vas-, réz-, és mangánsók. 15 A fermentációs közeg pH-ja a tenyésztés megindulásakor 6,0 és 7,8, előnyösen 6,5 és 7,5 közé kell hogy essék. A fermentáció optimális hőmérséklete 25—30 C°, de kielégítő termelés érhető el 23 és 33 C° közötti hőmérsékleten. A 20 fermentáció levegőztetése elég széles határok között változhat. Azt találtuk azonban, hogy 1 liter táptalajra percenként 0,3—3 liter levegő különösen előnyös. A maximális 23 671 RP és 23 672 RP termelést 2-8 napig tartó tenyésztés 25 után érjük el-, az időtartam lényegében a használt táptalajtól függ. A 23 671 RP és 23 672 RP antibiotikumok a fermentléből a következő módon különíthetők el: 30 A két antibiotikumot közvetlenül extraháljuk a fermentléből vízzel nem elegyedő oldószerekkel, például legalább 4 szénatomos alifás alkoholokkal, mint butanollal, észterekkel, mint etilacetáttal, klórozott oldószerekkel, mint diklóretánnal, 35 metilénkloriddal, vagy kloroformmal, vagy ketonokkal, mint metilizobutilketonnal. Ezt a műveletet előnyösen 7 vagy annál kissé nagyobb pH értéknél végezzük. Szűrés és dekantálás után a nyers keveréket az 40 említett szerves oldószeres oldatból csökkentett nyomáson való bepárlással, majd egy nem oldó vagy rosszul oldó anyaggal, például hexánnal való lecsapással különítjük el. A 23 671 RP és 23 672 antibiotikumok a 45 fermentlé szerves oldószeres kivonataiból azok esetleges bepárlása után kromatografálással elkülöníthetők. Ennek egyik kényelmes módja az, hogy a fermentlé kivonatát átbocsátjuk egy Florisil (magnéziumszilikát) oszlopon, majd azt frak- 50 cionáltan eluáljuk klórozott szénhidrogén alapú oldószerrendszerrel. Az eluátumnak kovasavgél-vékonyrétegen végzett első kromatográfiai frakcionálásával két frakciót kapunk, az A frakció 23 671 RP antibiotikumban dús és még 23 672 55 RP-t tartalmaz, a B frakcióban túlnyomó a 23 672 RP, és 23 671 RP-t is tartalmaz. Ezután az A frakciót egy szilikagél vagy alumíniumoxid oszlopon frakcionáltan kromatografáljuk, eluálószerként növekvő polaritású oldat- 60 rendszert tartalmazva. Alkalmas oldatrendszer hexán és etilacetát elegye fokozatosan növekvő etilacetát tartalommal vagy egy tiszta vagy kevert klórozott szénhidrogén sorozat, adóit esetben adalékként egy kevés szénatomos alkohollal, 65 például metanollal. A 23 671 RP-t tartalmazó frakciókat kovasavgél-vékonyrétegen végzett kromatografálással mutatjuk ki. Végül a 23 671 RP-t éter és hexán elegyéből átkristályosítjuk, majd a kristályokat izopropiléterrel mossuk. A B frakciót ugyancsak frakcionáljuk a 23 672 RP elkülönítésére olymódon, hogy átbocsátjuk egy Florisil oszlopon, és azt eluáljuk egy klórozott szénhidrogén és etilacetát alapú növekvő polaritású oldószersorozattal. A frakcionált eluálást kovasavgél-vékonyrétegen végzett kromatografálással követjük, és a 23 672 RP-t elválasztása után éter és hexán elegyből való átkristályosítással és széntetrakloridból való ujabb átkristályosítással tisztítjuk. A következő példák szemléltetik a találmány szerinti eljárás gyakorlati végrehajtását korlátozás szándéka nélkül. A továbbiakban az aktivitást mindig a diffúziós mikrobiológiai módszerrel határoztuk meg érzékeny mikroorganizmusként Staphylococcus aureus 209 P-t (ATCC 6538 P) használva és az eredményt összehasonlítva egy analitikai mintaként használt 640 jug/mg titerű tisztított 23 671 RP mintával. Ezt az aktivitást szilárd termékek esetében Mg/mg-ben fejezzük ki. A 23 672 RP aktivitását ugyancsak íig/mg-ben fejezzük ki, figyelembe véve, hogy a diffúziós módszerben a 23 671 RP négyszer olyan aktív Staphylococcus aureus 209 P-re, mint a 23 672 RP. 1. példa Egy 170 literes fermentorba betöltjük a következő anyagokat: pepton húskivonat glükózmonohidrát nátriumklorid 600 g 600 g (szárazanyag) 1200 g 600 g agar csapvízzel 240 g 110 literre kiegészítve. A keverék pH-ját 140 ml 10 n nátriumhidroxiddal beállítjuk 7,50-re. Ezután vízgőz átbuborékoltatásával 122 C°-on 40 percig sterilizáljuk a táptalajt. Lehűtés után a térfogata 120 liter, és a pH-ja 6,90. Ezután a táptalajt beoltjuk 200 ml Streptomyces chryseus DS 12 370 (NRRL 3892) rázott Erlenmeyer-tenyészettel. 26 óra hosszat 30 C°-on keverés és steril levegővel való levegőztetés közben inkubálunk. Ekkor a tenyészet alkalmas a termelő tenyészet beoltására. A termelő tenyésztést 800 literes fermentorban végezzük a következő anyagok jelenlétében: szeszmoslék szemesbab-őrlemény glicerin nátriumklorid csapvízzel 2 kg (szárazanyag) 16 kg 4 kg 2 kg 360 literre kiegészítve.
