164311. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 23 671 RP és 23 672 RP antibiotikumok előállítására
164311 17 18 A keverék pH-ját 400ml lGn nátriumhidroxid oldattal beállítjuk 8,25-re. Ezután a táptalajt vízgőz átbuborékoltatásával 120C°-on 40 percig sterilizáljuk. Lehűtés után 4 kg cereiózt tartalmazó 10 liter steril vizes oldatot adunk hozzá. 5 Ekkor a táptalaj térfogata 400 liter és a pH-ja 6,90. Ezután beoltjuk a 170 literes fermentorban a fent leírt módon készült 40 liter oltótenyészettel. A fermentációt 97 óra alatt 28 C°-on végezzük, miközben a fermentlevet percenként 10 260 fordulatú turbinakeverővel keverjük, és óránként 35 m3 steril levegővel levegőztetjük. A fermentlé pH-ja ekkor 7,55 és a térfogata 370 liter. A termelt antibiotikum mennyisége 110jug/ml. ' 15 2. példa Az 1. példában leírt módon kapott 10 liter 20 85 /xg/ml titerű fermentlevet keverővel ellátott tartályba öntjük, és hozzáadunk 900 g szűrést elősegítő anyagot, célszerűen kovaföldet, majd 1/4 óra hosszat 7,5 pH-nál keverjük. Ezután a keveréket átszűrjük egy 2 kg szűrést elősegítő anyag réteggel 25 ellátott szűrőn. 10 liter szüredéket gyűjtünk. A szüredéket előbb 4, majd 3 liter butanollal extraháljuk, az oldószer pH-ját előzőleg 6n sósavval 7-re állítva be. A butanolos kivonatot 30 C°-on 20 torr nyomáson 100 ml-re koncentráljuk. 30 Egy liter hexán hozzáadására a 23 671 RP és 23 672 RP nyers keveréke kicsapódik, a csapadékot mossuk, centrifugáljuk, és szárítjuk. Mennyisége 2,1 g, és a barna amorf por titere 36jug/mg. 3. példa Az 1. példában leírt módon kapott 380 liter 110jug/ml titerű fermentlevet betoljuk egy keverő- 40 vei ellátott tartályba, és a pH-ját híg nátriumhidroxid oldattal beállítjuk 8-ra. A keverést 1/2 óra hosszat folyatjuk 30 kg szűrést elősegítő anyag, célszerűen kovaföld hozzáadásával. A keveréket szűrőprésen átszűrjük, és a szűrőlepényt 6 n 45 nátriumhidroxid oldattal 8 pH-ra beállított 100 liter vízzel mossuk. Az így kapott 380 liter szüredéket 6n sósavval beállítjuk 7 pH-ra, 10 percig keverjük, majd 50 kétszintű centrifugában 230 liter metilénkloriddal ellenáramban extraháljuk. A metilénkloridos kivonatot 30 C°-on 20 torr nyomáson 1 liter térfogatra koncentráljuk. Ezután a metilénkloridos koncentrátumot átbocsátjük egy 7,5 cm átmérőjű és 65 cm 55 magas, 1,5 kg Florisilból álló oszlopon. A koncentrátum a Florisil rétegen felülről lefelé 3 óra alatt halad át. Ezután az oszlopot felülről lefelé átmossuk óránként 1,5 liter, összesen 15 liter metilénkloriddal. Az átfolyt folyadékot 60 kiontjuk, és az oszlopot olyan oldószersorozattal eluáljuk, amelyet 20 liter 95:5 térfogatarányú metilénklorid-metanol elegynek 5 liter metilénkloridhoz való fokozatos hozzáadásával kapunk. Az eluálás sebessége óránként 1,5 liter. 65 Az eluátumot 500 ml-ként frakcionáljuk, és így 44 frakciót kapunk. Minden frakciót vékonyréteg-kromatografálással megelemzünk olymódon, hogy 20 /xl oldatot egy 22 C°-on 87:13 térfogatarányú kloroform-metilalkohol elegy gőzével telített térben ráviszünk egy Merck F 254 kovasavgél vékonyrétegre. A vándorlást tömény kénsav ráporlasztásával követjük. Az Rf-értékek a következők: 23 671 RP, Rf = 0,55, 23 672 RP, Rf = 0,45. Az elemzés eredményei alapján külön összegyűjtjük a főképp 23 671 RP-ből és a főképp 23 672 RP-ből álló frakciókat, majd a kapott két oldatot 30 C°-on, 20 torr nyomáson bepároljuk, így 30 g 23 671 RP-t kapunk 525 Mg/mg titerű amorf világosbarna por alakjában és 7 g 23 762 RP-t amorf világosbarna por alakjában. 4. példa A 3. példa szerint .késfcült, 815/zg/mg titerű 36 g nyers 23 671 Rf* antiéiotikumot keverés közben feloldunk 180 til étetiJaban. Az acetonos oldathoz hozzáadunk 220 g Mérek F 254 kovasavgélt (0,05-0,2 mm), majd a keveréket 20 torr nyomáson 45 C°-on 4 óra hosszat szárítjuk. A maradékot rávisszük egy 5 cm átmérőjű 1 m magas, hexánnal telített 2 kg Merck F 254 kovasavgélből álló oszlop tetejére. Az oszlopon sorban átbocsátunk 5 liter hexánt, 8 liter 75:25 térfogatarányú hexán-etilacetát elegyet, 8 liter 50:50 térfogatarányú hexán-etilacetát elegyet és 6 liter 25:75 térfogatarányú hexán-etilacetát elegyet. Az átfolyt folyadékokat kiontjuk. Ezután az oszlopot 12 liter etilacetáttal eluáljuk. Az eluátumot 100 ml-ként frakcionáljuk, és a frakciókat vékonyréteg-kromatografálással a fent leírt módon analizáljuk. A 23 671 RP tartalmú frakciókat 30 C°-on, 20 torr nyomáson bepároljuk, így 20 g 23 671 RP antibiotikumot kapunk mintegy 1000jug/mg titerű amorf sárgás por alakjában. 5. példa A 3. példa szerint készült 16,5 g 460/ug/mg titerű nyers 23 671 RP antibiotikumot keverés közben feloldunk 250 ml metilénkloridban. Az oldathoz 250 ml izopropilétert adunk, ráncos szűrőn átszűrjük, majd átbocsátjük egy 4 cm átmérőjű 33 cm magas, 400 g 4 pH-ra megsavanyított alumíniumoxid oszlopon. Az oszlopot kifejlesztjük a következő oldószerek egymást követő átbocsátásával: 1. 1 liter 1:1 térfogatarányú metilénklorid•izopropiléter elegy, 2. 1 liter tiszta metilénklorid, 3. 1 liter 1:1 térfogatarányúmetilénklorid-kloroform elegy, 4. 1 liter tiszta kloroform és 5. 1 liter 9:1 térfogatarányú kloroform-metanol elegy. 9
