164094. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az EM-49 antibiotikum és összetevői előállítására

13 164094 14 Az EM-49-0, -ß, -7 és -6 minták mindegyikét éjjelen át 6n sósavval 110°-on hidrolizáljuk. Mindegyik hidrolizátumot a zsírsavrész eltávolítására éterrel extraháljuk. A visszamaradt anyagot aminosavelemzésre használjuk fel. A frakciók aminosavelemzése azt mutatja, hogy az EM-49-a és EM-49-0 különbözik az EM-49-7 és EM-49-6 frakcióktól: Molekulánként! aminosavcsoportok száma 2,4-diaminovajsav Leucin Fenilalanin EM-49-a 5 3 0 EM-49-/J 5 3 0 EM-49-7 5 2 1 EM-^9-6 5 2 1 Ezeknek a frakcióknak az infravörös spektruma az 5., 6., 7., illetőleg 8. ábrán látható. Mindegyik frakció az EM—49—hidrokloridhoz hasonlóan vízben, metanolban, etanolban, dimetilszulfoxidban és ecetsavban oldódik, és acetonban, etilacetátban, éterben és acetonitrilben oldhatatlan. Mindegyik frakció az EM-49-hez hasonlóan sókat alkothat. A hidrolizátumok éteres kivonatai az antibiotikumról lehasadt zsírsavakat tartalmazzák. Ezeket a metilészterek előállítására diazometánnal reagáltatjuk, majd a metilésztereket gázkromatográfia segítségével vizsgáljuk. Az EM-49-a-ból kapott zsírsavak az EM-49-/3-ból kapottaktól ugyanúgy különböznek, mint ahogy az EM-49 7 és 6 zsírsavai különböznek egymástól. Az EM-49-a-ß pár a 7-Ő pártól úgy különböztethető meg, hogy az utóbbi pár infravörös spektrumában 696cm-1-nél a fenilalanincsoportra jellemző kis maximum van. Hasonlóképpen a 7-5 pár ultraibolya spektrumában is 245 és 270 nm között a fenilalanin jellegzetes abszorpciója látható, és ez az abszorpció az a-ß pár ultraibolya spektrumában hiányzik. 12. példa: Az 5. példában leírt módon kapott 70 g acetonban oldhatatlan port 200 ml 7,5 pH-jú vízzel és butanollal kétszer extraháljuk. A vizes rétegeknek nincs antibiotikus hatása, ezért ezeket kiontjuk. A butanolos rétegeket egyesítjük, és négyszer 200-200 ml butanollal telített vízzel l,0pH-nál extraháljuk, Az egyesített vizes kivonatok tartalmazzák az EM-49-ből és a lassan mozgó frakcióból (SMF) álló hatóanyag legnagyobb részét. A vizes kivonatot vákuumban szirupsűrűségűre bepároljuk, és az antibiotikumot acetonnal kicsapjuk, így körülbelül 15 g acetonban oldhatatlan port kapunk. Az EM-49-et és a lsssan mozgó frakciót (SMF) előbb nagyjából szétválasztjuk azáltal, hogy a 15 g szilárd anyagot 30 ml metanolban oldjuk, és ezt az oldatot dietilaminoetilcellulózzal töltött 4,5 x 60 cm-es oszlopon átfolyatjuk. Miután a sötét szín legnagyobb része az oszlopból kioldódott, a lassan mozgó frakciót (SMF) 2% ecetsavat tartalmazó metanollal eluáljuk. Körülbelül 50 ml frakciót gyűjtünk, ekkor már több hatásos anyag IS az oszlopból nem távozik, ami kimutatható agar lemezeken korongpróbával Escherichia coli (SC 2927) baktériummal szemben. Ezután a frakciókat vékonyrétegkromatográfiával Gelman-20 kovasavlemezeken elemezzük, oldószerként butanol, izovajsav, piridin és víz 40:9:4:10 arányú rendszert használva, és Escherichia coli-val beoltott agar lemezeken bioautográfiával meghatározzuk. A lassan mozgó frakciót (SMF) tartalmazó részleteket 25 (Rf=0,15) egyesítjük, és bepárolva körülbelül 5g anyagot kapunk. Ezt a szilárd anyagot kovasav és cellulóz 2:1 súlyarányú keverékével töltött 3 x 60 cm-es oszlopon megoszlásosan kromatografáljuk, és ugyanazt az oldószert használjuk, mint a 30 vékonyrétegkromatografálásban. Ezen az oszlopon az EM—49 és a lassan mozgó frakció (SMF) jól szétválik, és ugyanolyan vékonyrétegkromatografálással elemezzük. A kívánt frakciókat egyesítjük, és bepárolva körülbelül 300 mg anyagot kapunk. Az 35 anyag további tisztítására a megoszlásos kromatografálást megismételjük. A mintát aceton és metanol 1:1 arányú elegyében oldjuk, és ugyanezzel az oldószerrel itatott Sephadex LH 20-szal töltött oszlopon áteresztjük. Amikor ugyanezen oldószerrel 40 kifejlesztjük a kromatogramot, elkülönített sávok láthatók. A lassan mozgó frakció (SMF) most az oldószer frontjával együtt lép ki. A frakciókat ismét vékonyrétegkromatografálással elemezzük, és a lassan mozgó frakció (SMF) egyetlen foltját 4S tartalmazó frakciókat egyesítjük, és bepároljuk. A végső kitermelés körülbelül 150 mg. A termék színe halványsárga, bioautografiailag tiszta, 310°-ig nem olvad meg, színe 270°-tói kezdve barnává kezd változni. 50 A kristályos reineckátot ebből a termékből úgy állítjuk elő, hogy 100 mg végterméket 5 ml vízben oldunk, és a pH-nak 2-3-ra beállítására híg sósavat adunk hozzá. Ezután víztiszta telített vizes 55 ammóniumreineckát oldatot csepegtetünk hozzá, amíg már több csapadék nem keletkezik. Ekkor centrifugáljuk, és a csapadékot 5 ml vízzel mossuk, majd megszárítjuk, és aceton és hexán elegyéből átkristályosítva 50 mg terméket kapunk. A kristá-60 lyos reineckát bíborszínű por, vízben oldhatatlan, de acetonban és metanolban könnyen oldódik. Nincs határozott olvadáspontja, és 198-200°-on elbomlik. A színpróbákban a következő eredményeket kapjuk: ninhidrinnel negatív, antronnal negatív, 65 hidrolizátum ninhidrinnel pozitív. 7