164094. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az EM-49 antibiotikum és összetevői előállítására
11 164094 12 amennyi oldódik. A fel nem oldódott anyagot centrifugálással elválasztjuk, 10 ml vízzel mossuk, és a felülúszó folyadékokat egyesítjük. 1,00 g metüoranzst 15 ml vízben szuszpendálunk, 5 ml dimetilformamidot adunk hozzá, és a keveréket addig melegítjük, amíg a metiloranzs éppen feloldódott. Ezt a meleg oldatot az EM-49 oldatához adjuk. A keveréket szobahőmérsékletre hűtjük, a szilárd anyagot centrifugálással elválasztjuk, háromszor 35 ml vízzel mossuk, és vákuumban szárítjuk. A nyers heliantátból az oldható részt feloldjuk 3 ml dimetilformamidban, az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk, és 3 ml dimetilformamiddal kétszer mossuk. Az egyesített dimetilformamidos oldatokhoz 90 ml vizet adunk, a csapadékot centrifugálással elválasztjuk, és 30-30 ml vízzel háromszor mossuk. Az EM-49-heliantát amorf anyag, és metanol és acetonitril 2:1 arányú elegyéből újra kicsapva tisztítható. Az így kapott anyagot 0,02 torr nyomáson és 100°-on 18 óra hosszat szárítjuk, majd a légköri nedvességgel egyensúlyba hozzuk. Olvadáspontja (Kofler-blokkban mérve) 242-244° (bomlik). Elemi összetétel (%): C 53,01: H 6,74: N 14,19: S 5,44 (víz 5,05). 2238 molekulasúlyra az elemi összetétel a Ci0 4Hi4 4N 2 4O 2 4S 4 tapasztalati képletnek felel meg. Az EM-49-heliantátot hidrokloriddá való átalakítására 10 ml 0,36 n sósavval 20 percig keverjük. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk, és 5 ml 0,36 n sósavval kétszer mossuk. Az egyesített felülúszó folyadékokat 320 mg aktívszénnel kezeljük. Kovaföldön átszűrve csaknem szinte- 35 len oldatot kapunk. A szűredéket kétszer 10 ml n-butanollal mossuk. A butanolt vákuumban eltávolítva amorf szilárd anyagot kapuk. Ezt finom porrá alakítjuk azáltal, hogy kevés metanolban oldjuk, etilacetátot adunk 40 hozzá addig, amíg az antibiotikum ki nem csapódik, majd az oldószert vákuumban eltávolít-10 15 20 25 30 juk. A port ezután 50ü -on és 0,02 torr nyomáson több (például 5) óra hosszat szárítjuk, majd éjjelen át a légköri nedvességgel egyensúlyba hozzuk. 11. példa: A 10. példában leírt eljárás szerint kapott 500 mg EM-49-hidrokloridot 5 ml vízben oldunk, és Whatman CM-52 cellulózzal (nátriumkarboximetilcellulóz) töltött 2,5x60 cm-es oszlopon 50°-on, óránként 75 ml áramlási sebességet használva kromatografáljuk. Az oszlopot 0,15 n nátriumklorid oldattal eluáljuk, és 600cseppből álló (körülbelül 24 ml térfogatú) frakciókat gyűjtünk. Az eluátum felületi feszültségét ellenőrizzük. Mivel az antibiotikum csökkenti a felületi feszültséget, az antibiotikumot tartalmazó állandó cseppszámú frakciók térfogata kisebb, mint az antibiotikumot nem tartalmazó frakcióké. A frakciótérfogatot az összes eluátum függvényében ábrázoló görbén az antibiotikumot inverz csúcsok jelzik. Az eluálást addig folytatjuk (körülbelül 161 ml-ig), amíg az EM-49-a, EM-49-0 és EM-49-7 három csúcsnak megfelelő eluátumot megkapjuk. Ekkor az oszlopot körülbelül 2 liter 0,2 n nátriumklorid oldattal eluáljuk, hogy a felületi feszültség maximumának megfelelő EM-49-Ő frakciót megkapjuk. Az EM-49-a, -0, -7 és -6 maximumokat tartalmazó frakciókat egymástól elkülönítve összegyűjtjük. Mindegyik frakciót térfogatának felét kitevő n-butanollal extraháljuk. A butanolos kivonatokat azonos térfogatú 0,36 n sósavval kétszer mossuk, majd bepároljuk. Mindegyik száraz maradékot metanolban oldjuk, etilacetáttal kicsapjuk, a csapadékot etilacetáttal és éterrel mossuk, 75°-on és 0,02 torr nyomáson fél óra hosszat szárítjuk, majd éjjelen át a légköri nedvességgel egyensúlyba hozzuk. A hidrokloridként kapott egyes frakciók összetétele a következő: H2 0 Összetétel (%) H N Cl (ionos) EM-49-a 5,84 42,96 8,16 13,41 11,85 EM-49-/3 8,91 43,49 7,85 13,68 11,06 EM^*9-7 8,86 43,42 6,96 12,92 10,64 EM-49-6 7,09 44,75 7,17 13,13 10,58 Vízmentes anyagra vonatkoztatva a fenti adatok 55 súlyokat és az ezek alapján számított empirikus a hidrokloridokra a következő közelítő molekula- képleteket szolgáltatják: Molekulasúly Empirikus képlet EM-49-a 1203 C46 H 95 N 12 Cl40 ls EM-49-0 1190 C47 H g9 N 13 Cl40 13 EM-49-7 1250 CsoH81 N 13 Cl 4 0 16 EM-49-6 1267 Csl H 86 N 13 Cl40i S 6
