164094. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az EM-49 antibiotikum és összetevői előállítására
7 164094 8 2. szakasz 6. példa: Oltóanyag: 100 ml az 1. szakaszból. Táptalaj: ugyanaz, mint az 1. szakasz tenyésztápközege. Az oltóanyagot és 1000 ml táptalajt 5 4000 ml-es Erlenmeyer-lombikban forgó rázógépen 25°-on 72 óra hosszat inkubáljuk. A rázógép percenként 280 fordulattal és 51 mm lökettel működik. 10 3. szakasz Oltóanyag: 3000 ml a 2. szakaszból. 15 Táptalajösszetétel 1«? kukoricalekvár 6,0 g (NH4 )H 2 P0 4 3,0 g élesztőkivonat 2,5 g 20 dextróz 10,0 g desztillált vízzel kiegészítve 1000 ml-re A pH-t beállítjuk 7,0-re CaC03 2,5 g 25 Az oltóanyagot 250 ml táptalajhoz adjuk, és azt 144 óra hosszat inkubáljuk. Az inkubálás alatt a táptalajt percenként 0,61 m felületi levegősebességgel és 0,7 kg/cm2 nyomással levegőztetjük. Eközben a táptalajt literenként 0,4 watt és és 30 percenként 155 fordulat alkalmazásával keverjük. 3. példa: 35 A 2. példa szerint kapott 209 liter fermentlé pH-ját 1,5 liter tömény sósavval beállítjuk 2,0-re. A megsavanyított közeghez szűrést elősegítő anyagként 15 kg Hyflo-t adunk. A keveréket szűrve a szűrőn 41 kg oldhatatlan anyag marad vissza. Ezt 40 10 liter vízzel mossuk, és a mosóvizet a szűredékkel egyesítve 190 liter folyadékot kapunk. A 41 kg mosott szűrőlepényt eldobjuk. 45 4. példa: A 3. példa szerint kapott 190 liter szűredéket 56 liter vízzel telített n-butanollal háromszor extraháljuk. A butanolos rétegeket (194 liter) 50 egyesítjük, és 45°-nál alacsonyabb hőmérsékleten vákuumban kis térfogatra (2,3 literre) bepároljuk. 5. példa: 55 A 4. példa szerint kapott koncentrátumból 50 ml-t 750 ml acetonnái hígítunk, és a keletkezett csapadékot centrifugálással elválasztjuk. A csapadékot 60 ml acetonban szuszpendálva mossuk, majd 60 centrifugáljuk. Ezt a műveletet háromszor 60 ml etilacetátot és utoljára háromszor 60 ml étert használva megismételjük. A csapadékot levegőn szárítjuk, porítjuk, és vákuumban szárítva 1,4 g világos sárgásbarna port kapunk. 65 Az 5. példában kapott 1,4 g acetonban oldhatatlan port n-propanol, n-butanol, víz és ecetsav 50:75:100:2 térfogatarányú rendszert használva ellenáramú megoszlással tovább tisztítjuk. 29 átvitelt végzünk csövenként mindegyik fázisból 40 ml-t használva. Agar lemezen papírkorong diffúziós próbával meghatározva a legnagyobb hatóképességet a 11. csőben találjuk. A 8-14. csövek tartalmát egyesítjük, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A maradékot kevés metanolban feloldjuk, és az antibiotikumot aceton és éter hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot éterrel jól kimossuk, levegőn, majd vákuumban szárítjuk, és így 0,466 g világos sárgásbarna port kapunk. Ez az anyag főleg az EM-49 antibiotikum bázisos peptidje hidroklorid alakjában. Az ilyen körülmények között előállított fermentleben cirkulál nem mutatható ki. Elemi összetétel: (%): C 45,58, H 7,31, N 14,42, Q 11,86 (ionos) Optikai forgatóképesség: c=l,0 vízben: 589 nm -42 ± 3° 578 nm -44 546 nm -50 436 nm -91 A hidrokloridként jelenlevő antibiotikum infravörös spektruma az 1. ábrán látható. A 2. ábrán a hidrokloridként jelenlevő antibiotikum 100MHz-es NMR spektrumát tüntetjük fel. Az antibiotikum kimutatására Whatman 1. szűrőpapíron papírkromatografálva Escherichia coli ATCC 10536-val szembeni bioautográfiát használtunk. Oldószer-rendszer (térfogatrészek) Rf-érték n-butanol-ecetsav-víz (4:1:5) 0,71 n-propanol-n-butanol-víz (2:3:4) 0,57 kloroform-metanol-víz (5:4:2) 0,38 kloroform-metanol-1 %-os ecetsav (5:4:2) 0,35 kloroform-metanol-0,5 n ammóniumhidroxid (5:4:2) 0,91 Az EM—49 antibiotikum hidrokloridja vákuumban 180 és 207° között bomlás közben olvad meg. Vízben, metanolban, etanolban, dimetilszulfoxidban és ecetsavban oldható, és acetonban etilacetátban, éterben és acetonitrilben oldhatatlan. A fenti eljárás szerint előállított 2,30 g EM-49 antibiotikum-hidrokloridot 6n sósavval 110°-on 16 óra hosszat hidrolizáltuk, és a hidrolizátumot az ismert Stein-Moore módszerrel elemezve 3,95 mikromól leucint és 7,35 mikromól diaminovajsavat mutattunk ki. A hidrolizátumban 0,86 mikromól fenilalanin is volt, egyéb aminosavak csak nyomokban. Az EM-49 antibiotikum a treonin hiánya révén különböztethető meg az egyéb peptid antibiotikumoktól, például a drkulintól, polimixinektől és polipeptintől. A hidrolizátumbol éteres extrahálással egy eddig még nem azonosított zsírsavat is kinyertünk. Ez a zsírsav az antibiotikumnak körülbelül 10s%-a. A hidrokloridnak 0,05 n sósavban meghatározott ultraibolya spekt-4
