163901. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-formilrifamicin SV-származékok előállítására
5 módszer szerint vizsgáltuk (Nature, New Biology, 229, 111. oldal, 1971.). A különböző gyógyszerkoncentrációk polimerázaktivitásra gyakorolt hatását úgy határozzuk meg, hogy 3 H-dTTP-t (triciumozott timin-dezoxi-ribozid-trifoszfát) beépítünk az oldhatatlan frakcióba. A kísérleti eljárásra jellemző példát a következőkben közöljük: 1. példa: Víruselkülönítés és a vírusos polimeráz tisztítása A patkány sarcoma-vírussal (Moloney izolátum) transzformált patkánysejtekből (78A1-sejtek) és a patkány sarcoma vírussal (Harvey izolátum) transzformált egérsejtekből (MEH-sejtek) vírust különítünk el és tisztítunk meg, korábbi irodalmi adatok alapján (Green és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 67 385-393. oldal, 1970: Rokutanda és munkatársai, Nature, 227, 1026-1028. oldal, 1970). A vírus-polimerázt 20-40-szeres tisztításnak vetjük alá úgy, hogy a tisztított vírust 0,1 mól konyhasó, 0,01 mól Trisz-puffer (pH 7,6) és 0,001 mól EDTE-be adagolt 0,5% NP-40-nel (Nonidet P-40) 5 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután zónacentrifugálást végzünk 10 mmól nátriumfoszfátpuffer (pH 7,4), 2,5 mmól magnéziumklorid, 10 mmól ditiotreitrol és 5% glicerin elegyben, mint oldószerben készített 15—30%-os cukor-sorozattal 24 óra hosszat 38 000 fordulat/perc Spinco SW41 rotorban. Az enzimaktivitási csúcs-frakciót (13-17-ig) a 22 frakció közül egyesítjük és 3P%-os glicerinben -70 C°-on tároljuk. A DRNS-polimeráz vizsgálata Az enzim inkubálását 1 óra hosszat, 37 C° hőmérsékleten 100 /d reakcióelegyben végezzük, mely 40 mmól Trisz-puffert (pH 8,0), 5 mmól ditiotreitrolt, 30 mmól nátriumkloridot, 2,5 mmól magnéziumkloridot, 0,1 mmól dATP-t, dGTP-t, dCTP-t és 10 MCÍ 3 H-dTTP-t (12-18 Ci/mmól) tartalmaz, amint azt Green és munkatársai leírják (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385-383, 1970.). A reakciót 150 pl 1 n perklórsav hozzáadásával fejezzük be. Hordozóként borjú kedezmirigy (thymus) DRNS-t (100 jug) adunk hozzá: a rádióaktív DRNS-terméket az előbbiekben említett két cikkben közöltek szerint állítjuk elő. Az endogén RNS-től függő DRNS-polimeráz aktivitását azután mérjük, hogy 0,01% NP-40-t adunk hozzá a tisztított vírushoz a vizsgálat idején. A tisztított vírus-polimeráz RNS-polimeráz aktivitását 2 /xg poli d(AT)'vel, mint sablonnal NP-40 nélkül mérjük. 6 Gátlási vizsgálatok rifamicin származékokkal Rifamicin származékból dimetilszulfoxidban (DMSO) 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk 5 és 4 C c> hőmérsékleten tartjuk. Az endogén RNS-től függő DRNS-polimeráz aktivitásgátlást oly módon vizsgáljuk, hogy dimetilszulfoxidban megfelelően oldott 2 ml rifamicin-származékot, vagy 2 pl dimetilszulfoxidot (kontrol) adunk a vizsgálati 10 keverékhez, mielőtt a 15-30 jug vírus-fehérjét tartalmazó feltárt vírushoz adnánk. Az enzim inkubálását 37 C°-on 60 percig végezzük. A tisztított enzim gátlását 2 pl rifamicin-származék, vagy dimetilszulfoxid 30 pl enzimmel (1-2 jug i5 fehérje) való elő-inkubálásával vizsgáljuk. Az elő-inkubálás időtartama 10 perc, hőmérséklete 37 C°: ezután 70 ;ul szubsztrátumelegyet adunk hozzá és a keveréket tovább inkubáljuk és a fenti eljárás szerint kezeljük. 20 Reprezentatív vizsgálatokban a 11., 12, 13., 14., 15. és 16. példák találmány szerinti vegyületeivel a 2-100 jug/ml vagy ennél kisebb koncentrációk a 3 H-dTTP beépülését a kontrol 25 vizsgálatához képest több mint 10%-kal csökkentették. Ez egyértelműen igazolja az RNS-daganat-vírusok okozta rákkeltés mechanizmusának gátoltságát, ahogyan erre a mechanizmusra a legújabb biokémiai szempontok utalnak. 30 A reverz transzkriptázok gátló hatását megerősítik a patkány leukémia-vírus polimerázával végzett vizsgálatok is. A patkány leukémia-vírus RNS-polimerázt TRITON X 100 feltárt vírusból készítjük 35 Gallo és munkatársai által leírt módon (Nature, New Biology, 232, 141. oldal, 1971.). Mindkét vírus-fajtát, a Rauscher- és Moloney-típust, előzetesen tisztítjuk oly módon, hogy 1,16 g/ml szacharóz sűrűségi sorozat tartományban megkötjük kezdeti 40 kissebességű centrifugálás után a sejttörmelék kiküszöbölésére, és 60%—20% szacharóz sorozatban pufferoljuk. A víruskészítmény végső koncentrációja 1011 részecske/ml. Sablonként 70S RNS-t használunk. Enzimgátlásban az 50 Mg/ml vagy ez 45 alatti koncentrációk bizonyulnak hatásosaknak. Mintegy 50%-os gátlást lehet elérni például a találmány tárgyát képező reprezentatív vegyületek olyan kis koncentrációivá, mint 5 jug/ml. Hasonló eredményeket kapunk emberi eredetű ráksejt polimeráz használatával. Ez esetben a szelektív hatás jellemzésére normális sejtek polimerázaira kifejtett gátló hatást is vizsgáljuk. Az I. 55 általános képletű jellemző rifamicin-származékok (1) normális emberi - PHA-val serkentett -vérlimfocitákból, (2) normális donortól származó limfoblaszt-sejtből és (3) emberi leukémiás vér-limfoblasztból elkülönített két tisztított DRNS-poli-60 merázra gyakorolt hatását kiértékeljük. Mesterséges és/vagy natív sablonokat használunk. Az alábbiakban közlünk jellemző példát a 65 kísérleti eljárásra: 3
