163901. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-formilrifamicin SV-származékok előállítására

163901 8 Emberi vér limfoblasztok. Leukoforézissel leukémiás limfoblasztokat különítünk el akut limföcita leukémiában (ALL) szenvedő betegek perifériás véréből. A sejteket 5 kimossuk és az eritrocitákat hipotóniás sejtoldattal eltávolítjuk. Normális limfocitákat különítünk el egészséges donorok perifériás véréből, miután a granulocitákat 10 nylon-oszlopkromatográfiával eltávolítottuk. A DRNS-polimeráz aktivitásának fokozására 72 óra hosszat növényi hemagglutininnal (PHA) az előbbiekben leírt módon serkentünk (Gallo és munkatársai: Nature, 228, 927. oldal, 1970: Gallo és 15 munkatársai, Science, 165, 400. oldal, 1968.). Mivel a sejtek megfelelő mennyiségeinek hozzáférhetőségében nehézségek állnak fenn, emberi, „normális" szövettenyészeti sejtet (1788) haszna- 20 lünk kevésbé tisztított DRNS-polimeráz forrásként a kezdeti áttekintő tanulmányokhoz. Az érdeklődésre számot tartható vegyületeket ezután részletesebben tanulmányozzuk a normális- és leukémiás vérlimfocitákból kapott tisztább enzimekkel. E 25 szövettenyészeti sejtek az Associated Biomedic System, Inc. készítményei. DRNS-polimeráz készítmények 30 Normális (PHA-val serkentett) vér limfocitáiból, valamint 1788 limfoid sejtekből és leukémiás vér limfocitáiból sejt-DRNS-polimerázt extrahálunk, ezt megtisztítjuk, hipotóniás pufferben homogenizáljuk, 35 amelyet az extralizoszóma-tabletták TRITON X 100-al és/vagy nagy sótartalmú oldattal való extrakciója követ. Az elkülönítő centrifugálás után a sejt-extraktumokat DEAE-cellulózzal, foszfocellulózzal, és Sephadex G 200-al töltött oszlopon 40 kromatografálva tisztítjuk. A DRNS-polimeráz vizsgálatai 45 A DRNS-polimeráz vizsgálatokat 100 (ű végső térfogattal végezzük. A vizsgálati keverék 50 mmól Trisz-sósavpuffert (pH 8,3), 6,0 mmól magnéziumacetátot, 8,0 mmól ditiotreitrolt, 60 mmól nátriumkloridot tartalmaz. A pH beállítását az 50 előzetesen dimetílszulfoxidban oldott inhibitorok hozzáadása után végezzük. A dimetilszulfoxid végső koncentrációja 0,5%, és az összes kontrolminták a dimetilszulfoxidot ebben a mennyiségben tartalmazzák. A vizsgálatokhoz olyan enzimkoncentrációt 55 alkalmazunk, mely mintegy 1,0 pmól/óra beépülést katalizál. Az esetek többségében az enzimet az inhibitorral 5 percig előinkubáljuk. Ezután a reakciót oly módon iniciáljuk, hogy hozzáadunk vagy szintetikus DRNS-t, [poli d(AT), Miles Lab.] 60 és DRNS-RNS hibridet (oligo dT. poli rA) 5 /ug/ml arányban, vagy natív mintát: 50 Mg/ml aktívált lazac-sperma DRNS-t és endogén 70S vírus DRNS-t: 10 piCi (3 H-metil>TTP (New England Nuclear, 18,6 mCi) jumól, liofilizált és 0,01 mólos 65 sósavban használat előtt közvetlenül újra oldva, és dATP (8X10-5

mól DRNS-el vagy DRNS-el imitált reakciók). Néhány kísérletben az enzim inkubálását nem végezzük inhibitorral. Ezekben az esetekben a reakciók iniciálását úgy végezzük, hogy az enzimet inhibitort tartalmazó teljes elegyhez adjuk. A reakcióelegyből mintákat veszünk az inkubálás megindulásának kezdeti szakaszában, majd 30 perc múlva. A reakciót 2 ml 0,08 mólos nátriumpirofoszfát hozzáadásával fejezzük be, majd 12,5%-os hideg triklórecetsav-oldatban DRNS hordozóval (400 /ig) kicsapjuk. A termékeket Millipore-szűrőkön gyűjtjük, 5% triklórecetsawal és 1 ml dimetilszulfoxid-etanol - 0,1 mól nátriumklorid keverékével (0,5:70:29,5) erőteljesen mossuk, szárítjuk, majd 2 ml BBS3-ban (Beckman) és 10 ml likvifluórban (New England Nuclear) Packard-féle folyadék szcintillációs számlálóban számláljuk. Reprezentatív kísérletekben a 11. és 12. számú példákban leírt vegyületeket 5-10 /xg/ml koncentrációban alkalmazva 50%-os gátlás észlelhető a leukémiás polimeráznál szintetikus DRNS-sablonnal. Szintetikus RNS-sablonnal (poli rA. rU) a reakciók még érzékenyebbek. Natív mintával normális és daganatos sejt-polimerázon véghezvitt reprezentatív kísérletek azt mutatják, hogy a daganat-enzimek érzékenyebbek a vizsgált vegyületekre. A 12. számú példa szerinti vegyület például 5 Mg/ml koncentrációban a daganatpolimerázt 50%-ban gátolja, ugyanakkor a normális polimerázra gyakorlatilag hatástalan. Az új rifamicin származékok által mutatott egyéb biológiai jellemzők közé sorolható a gócképződés gátlása egereken, patkányokon és emberi sejteken, a patkány sarcoma vírus Moloney-és Kirsten-törzsével: a vírustermelés szelektív gátlása a már transzformált egér- és emberi sejtekben: visszafejlődött sejtek felfedése a patkány sarcoma vírus-transzformálta nemproduktív egér- és patkánysejtrendszereket használva. Megerősítést nyert továbbá, hogy a találmány szerinti hidrazon-vegyületek ezen kívül szelektíven toxikusak a vírus-transzfolmálta egér-, patkány- és emberi sejtekre, a telepképző képességre való vizsgálatokban. Annak bizonyítására, hogy a találmány szerinti vegyületek milyen hatásfokkal gátolják a Moloneysarcoma vírus BALB/3T3 szövettenyészeteken előidézett gócképződését, a következők szerint járunk el: BALB/3T3 sejttenyészeteket tenyésztünk 250 ml-es műanyagedényekben táptalajon, mely az Eagle-féle minimális esszenciális közeget 10% magzati marhaszérummal tartalmazza. A sejtszámlálást Coulter-számlálóval végezzük, miután a sejteket tripsin-EDTE-vel szuszpendáltuk, és a szaporító közegben hígítjuk. Moloney patkány-sarcoma vírust alkalmazunk daganat-homogenitásként. Négyszer átvezetjük a svájci-eredetű, nagy áthatolóképességű 4