163900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-formilrifamicin SV-származékok előállítására
5 163900 6 1. Példa: Víruselkülönítés és a vírusos polimeráz tisztítása A patkány sarcoma-vírussal (Moloney izolátum) transzformált patkánysejtekből (78Al-sejtek) és a patkánysarcoma vírussal (Harvey izolátum) transzformált egérsejtekből (MEH-sejtek) vírust különítünk el és tisztítunk meg, korábbi irodalmi adatok alapján (Green és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., Amerikai Egyesült Államok, 67, 385-393 oldal, 1970: Rokutanda és Munkatársai, Nature, 227, 1026-1028. oldal, 1970). A víruspolimerázt 20-40-szeres tisztításnak vetjük alá úgy, hogy a tisztított vírust 0,1 mól konyhasó, 0,01 mól Trisz-puffer (pH=7,6) és 0,001 mól EDTE-be adagolt 0,5% NP-40-el (Nonidet P-40) 5 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután zónacentrifugálást végzünk 10 mól nátriumfoszfát-puffer (pH=7,4), 2,5 mmól magnéziumklorid, 10 mmól ditiotreitrol és 5% glicerin elegyben, mint oldószerben készített 15-30%-os cukor-sorozattal 24 óra hosszat 38 000 fordulat/perc Spinco SW41 rotorban. Az enzimaktivitási csúcs-frakciót (13-17-ig) a 22 frakció közül egyesítjük és 3P%-os glicerinben —70C°-on A DRNS-polimeráz vizsgálata Az enzim inkubálását 1 óra hosszat, 37 C° hőmérsékleten 100/xl reakcióelegyben végezzük, mely 40 mmól Trisz-puffert (pH 8,0), 5 mmól ditiotreitolt, 30 mmól nátriumkloridot, 2,5 mmól magnéziumkloridot, 0,1 mmól dATP-t, dGTP-t, dCTP-t és ,10|uCi 3 H-dTTP-t (12-18 Ci/mmól) tartalmaz, amint azt Green és munkatársai leírják (Proc. Nat. Acad. Sei. U.S., 67, 385-383, 1970). A reakciót 150jtd In perklórsav hozzáadásával fejezzük be. Hordozóként borjú kedezmirigy (thymus) DRNS-t (100 Mg) adunk hozzá: a radioaktív DRNS-terméket az előbbiekben említett két cikkben közöltek szerint állítjuk elő. Az endogén RNS-től függő DRNS-polimeráz aktivitását azután mérjük, hogy 0,01% PN-40-et adunk a tisztított vírushoz a vizsgálat idején. A tisztított vírus-polimeráz RNS-polimeráz aktivitását 2 Mg pori d(A-T)-vel, mint sablonnal NP-40 nélkül mérjük. Gátlási vizsgálatok rifamicin származékokkal Rifamicin származékból dimetilszulfoxidban (DMSO) 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk és 4 C° hőmérékleten tartjuk. Az endogén RNS-től függő DRNS-polimeráz aktivitásgátlását olymódon vizsgáljuk, hogy dimetilszulfoxidban megfelelően oldott 2M1 rifamicin-származékot, vagy 2M1 dimetilszulfoxidot (kontrol) adunk a vizsgálati keverékhez, mielőtt a 15—30 Mg vírus-fehérjét tartalmazó feltárt vírushoz adnánk. Az enzim inkubálását 37 C°-on 60 percig végezzük. A tisztított enzim gátlását 2 M1 rifamicin-származék, vagy dimetilszulfoxid 30 M1 enzimmel (1—2 Mg fehérje) való elő-inkubálásával vizsgáljuk. Az előinkubálás időtartama 10 perc, hőmérséklete 37 C°: ezután 70M1 szubsztrátumelegyet adunk hozzá és a keveréket tovább inkubáljuk és a fenti eljárás szerint kezeljük. Reprezentatív vizsgálatokban a 4, 5, 6, 13, 14 5 és 16. példák találmány szerinti vegyületeivel a 2—100 Mg/ml vagy ennél kisebb koncentrációk a 3H-dTTP beépülését a kontroll vizsgálatokhoz képest több mint 10%-kal csökkentették. Ez egyértelműen igazolja az RNS-daganat-vírusok okoz-10 ta rákkeltés mechanizmusának gátoltságát, ahogyan erre a mechanizmusra a legújabb biokémiai szempontok utalnak. A reverz transzkirptázok gátló hatását megerősítik a patkány leukémia-vírus polimerázával végzett 15 vizsgálatok is. A patkány leukémia-vírus RSN-polimerázt TRITOn xlOO feltárt vírusból készítjük Gallo és munkatársai által leírt módon (Nature, New Biology, 232, 141. oldal, 1971.) Mindkét vírus-fajtát, a Rauscher- és Moloney-típust, előzete-20 sen megtisztítjuk olymódon, hogy 1.16 g/ml szacharóz sűrűségi sorozat tartományban megkötjük kezdeti kissebességű centrifugálás után a sejttörmelék kiküszöbölésére és 60%—20% szacharóz sorozatban pufferoljuk. A víruskészítmény végső koncent-25 rációja 1011 részecske/ml. Sablonként 70S RNS-t használunk. Enzimgátlásban az 50 Mg/ml vagy ez alatti koncentrációk bizonyulnak hatásosaknak. Mintegy 50%-os gátlást lehet elérni például az 5., 6. és 14. példabeli jellemző vegyületek olyan kis 30 koncentrációival, mint 10—25 Mg/ml. Hasonló eredményeket kapunk emberi eredetű ráksejtpolimeráz használatávlO, Ez esetben a szelektív hatás jellemzésére normális sejtek polimerázaira kifejtett gátló hatást Ez esetben a szelektív 35 hatás jellemzésére normális sejtek polimerázaire kifejtett gátló hatást is vizsgáljuk. Az I. általános képletű jellemző rifamicin-származékok (1) normális emberi (PHA-val serkentett) vérlimfocitákból, (2) normális donortól származó limfoblasztsejtből 40 és (3) emberi leukémiás vér-limfoblasztból elkülönített két tisztított DRNS polimerázra gyakorolt hatását kiértékeljük. Mesterséges és/vagy natív sablonokat használunk. Az alábbiakban közlünk jellemző példát a 45 kísérleti eljárásra: Emberi vér limfoblasztok. Leukoforézissel leukémiás limfoblasztokat különítünk el akut limfocita leukémiában (ALL) 50 szenvedő betegek perifériás véréből. A sejteket kimossuk és az eritrocitákat hipotóniás sejtoldattal eltávolítjuk. Normális limfocitákat különítünk el egészséges donorok perifériás véréből, miután a granulocitákat 55 nylon-oszlopkromatográfiával eltávolítottuk. A DRNS-polimeráz aktivitásának fokozására 72 óra hosszat növényi hemagglutininnal (PHA) az előbbiekben leírt módon serkentünk (Gallo és munkatársai: Nature, 228, 927. oldal, 1970: Gallo 60 és munkatársai, Science, 165, 400. oldal, 1968). Mivel a sejtek megfelelő mennyiségeinek hozzáférhetőségében nehézségek állnak fenn, emberi, „normális" szövettenyészeti sejtet (1788) használunk kevésbé tisztított DRNS-polimeráz forrásként 65 a kezdeti áttekintő tanulmányokhoz. Az érdeklő-3
