163900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-formilrifamicin SV-származékok előállítására

7 163900 8 désre számot tartható vegyületeket ezután részletesebben tanulmányozzuk a normális- és leukémiás vér-limfocitákból kapott tisztább enzimekkel. E szövettenyészeti sejtek az Associated Biomedic System, Inc. készítményei. DRNS-polimeráz készítmények Normális (PHA-val serkentett) vér limfocitáiból, valamint 17881imfoid sejtekből és leukémiás vér limfocitáiból sejt-DRNS-polimerázt extrahálunk, azt megtisztítjuk, hipotóniás pufferben homogenizáljuk, amelyet az extralizoszóma-tabletták Triton xlOO-al és/vagy nagy sótartalmú oldattal való extrakciója követ. Az elkülönítő centrifugálás után a sejt extraktumokat DEAE-cellulózzal, foszfocellulózzal, és Sephadex G 200-al töltött oszlopon kromatografálva tisztítjuk. A DRNS-polimeráz vizsgálatai A DRNS-polimeráz vizsgálatokat 100/d végső térfogattal végezzük. A vizsgálati keverék 50 mmól Trisz-sósavpuffert (pH 8,3), 6,0 mmól magnéziumacetátot, 8,0 mmól ditiotreitrolt, 60 mmól nátriumkloridot tartalmaz. A pH beállítását az előzetesen dimetilszulfoxidban oldott inhibitorok hozzáadása után végezzük. A dimetilszulfoxid végső koncentrációja 0,5%, és az összes kontrollminták a dimetilszulfoxidot ebben a mennyiségben tartalmazzák. A vizsgálatokhoz olyan enzimkoncentrációt alkalmazunk, mely mintegy l,0pmól/óra beépülést katalizál. Az esetek többségében az enzimet az inhibitorral 5 percig előinkubáljuk. Ezután a reakciót olymódon iniciáljuk, hogy hozzáadunk vagy szintetikus DRNS-t, [poli d(A-T), Miles Lab.] és DRNS-RNS hibridet (oligo dT. poli rA) 5 /zg/ml arányban, vagy natív mintát: 50jug/ml aktivált lazac-sperma DRNS-t és endogén 70S vírus DRNS-t: IOMCÍ [^H-metil (-TTP) New England Nuclear, 18.6 mCi] ßmol, liofilizált és 0,01 mólos sósavban használat előtt közvetlenül újra oldva, és dATP^xlO"5 mól szintetikus sablonnal) vagy mind a három dezoxinukleozid-trifoszfátot (8x1b"5

mól DRNS-el vagy DRNS-el végzett reakciók). Néhány kísérletben az enzim inkubálását nem végezzük inhibitorral. Ezekben az esetekben a reakciók iniciálását úgy végezzük, hogy az enzimet inhibitort tartalmazó teljes elegyhez adjuk. A reakcióelegyből mintákat veszünk az inkubálás megindulásának kezdeti szakaszában, majd 30 perc múlva. A reakciót 2 ml 0,08 mólos nátriumpirofoszfát hozzáadásával fejezzük be, majd 12,5%-os hideg triklórecetsav-oldatban DRNS hordozóval (400 jug) kicsapjuk. A termékek Mülipore-szűrőkön gyűjtjük, 5% triklórecetsawal és 1 ml dimetilszulfoxid-etanol — 0,1 mól nátriumklorid keverékével (0,5:70:29,5) erőteljesen mossuk, szárítjuk, majd 2 ml BBS3-ban (Beckman) és 10 ml likvifluorban (New England Nuclear) Packard-féle folyadék szcitillációs számlálóban számláljuk. Reprezentatív kísérletekben az ^5., 6. és 14. példákban leírt vegyületeket 5-10jug/ml koncentrációban alkalmazva 50%-os gátlás észlelhető a magzati marhaszérummal tartalmazza. A sejtszámlálást Coulter-számlálóval végezzük, miután a sejteket tripsin-EDTE-vel szuszpendáltuk, és a szaporító közegben hígítjuk. Moloney patkány-5 sarcoma vírust alkalmaztunk daganat-homogenitásként. Négyszer átvezetjük a svájci-eredeű, nagy áthatolóképességű egérembrió sejtkészítményen és megvizsgáljuk a góc-képző egységekre BALB/3T3 sejtekben. A vizsgálatok végzésekor Hartley és 10 Rowe, (Proc. Nat. Acad. Sei., 55, 780. oldal, 1966) módszerének változatát alkalmazzuk. Munkánk során az edényekbe l-2xl06 sejteket adagolunk 25 ml táptalajba és 37 C° hőmérsékleten 24 óráig inkubáljuk. A folyadék eltávolítása 15 után előre meghatározott számú gócképző egység mellett vírust viszünk 0,5 ml táptalajba és az egyrétegű sejteken 90 percig, 37 C° hőmérsékleten adszorbeálni hagyjuk. Az adszorpciós periódus végeztével valamely rifamicin-származék (melyet 20 előzőleg dimetilszulfoxidban 1 mg/ml koncentrációban oldunk) előre meghatározott, 5—10 fig/ml dózis közötti mennyiségét a 25 ml táptalajra visszük, és a tenyészeteket az inkubátorba visszahelyezzük. Egy külön tenyészet táptalajára 25 kontrollként csak dimetilszulfoxidot adunk. A beoltás után 3 nappal a tenyészeteken folyadékcserét hajtunk végre, és a transzformált sejtgócokat naponta hétszer megszámláljuk. ,. Ezzel a módszerrel tanulmányozzuk a Vesicularis Stomatitis (hólyagos szájgyulladás) vírusát, a New Jersey savótípust. A vírus szaporításának és vizsgálatának módszerét Hackett és munkatársai írják le (Virology, 31, 114 oldal, 1967). , E tulajdonságok azt igazolják, hogy e vegyületek hatékony gátló aktivitást fejtenek ki állatokon a vírus okozta daganatokkal szemben. leukémiás polimeráznál szintetikus DRNS-sablonnal. Szintetikus RNS-sablonnal (poli rA.rU) a reakciók 40 még érzékenyebbek. Natív mintával normális és daganatos sejt-polimerázon véghezvitt reprezentatív kísérletek azt mutatják, hogy a daganat-enzimek érzékenyebbek a vizsgált vegyületekre. 45 Az új rifamicin származékok által mutatott egyéb biológiai jellemzők közé sorolható a gócképződés gátlása egereken, patkányokon és emberi sejteken, a patkány sarcoma vírus Moloney-és Kirsten-törzsével: a vírustermelés szelektív gátlása 50 a már transzformált egér- és emberi sejtekben: visszafejlődött sejtek felfedése a patkány sarcoma vírus-transzformálta nemproduktív egér- és patkánysejt-rendszereket használva. Megerősítést nyert továbbá, hogy a találmány szerinti hidrazon-vegyü-55 letek ezen kívül szelektíven toxíkusak a vírustranszformálta egér-, patkány-, és emberi-sejtekre, a telepképző képességre való vizsgálatokban. Annak bizonyítására, hogy a találmány szerinti vegyületek milyen hatásfokkal gátolják a Moloney 60 sarcoma vírus BALB/3T3 szövettenyészetekben előidézett gócképződését, a következők szerint járunk el: BALB/3T3 sejttenyészeteket tenyésztünk 250 ml-es műanyagedényekben táptalajon, mely az 65 Eagle-féle minimális esszenciális közeget 10% 4