163848. lajstromszámú szabadalom • Eljárás prosztaglandinok előállítására
3 163848 4 Találmányunk tárgya eljárás prosztaglandinok előállítására alifás észterből lipáz enzimekkel (EC. 3.1.1. alosztály). Elvégezhetjük az eljárást állati vagy gomba eredetű lipázzal. Előnyösen alkalmazhatunk homogén, kereskedelmi lipáz készítményeket, melyekkel a prosztaglandionk metilészterei vizes szuszpenzióban kvantitatív elbonthatok. Találmányunk szerint különösen célszerűnek találtuk az alábbi enzimek alkalmazását: mikróbiális eredetű, 30-35 Desnuelle egység fajlagos aktivitású Lipase „Saiken" A (Nagase) (EC.3.1.1.3.), vagy állati eredetű, 25 Desnuelle egység fajlagos aktivitású pancreas lipáz. (EC. 3.1.1.3). 1 Desnuelle egység az enzim fajlagos aktivitása 1 mg-ra vonatkoztatva, ha 1 mg enzim pH-7,4 értéken 1 mikromól olajsavat szabadít fel 40%-os pálmaolaj szuszpenzióból 1 perc alatt (P. Desnuelle. A duances in Enzymology, 23j 129, 1961). Az alábbi kísérletet végeztük számos észteráz hatású enzimmel, melyek részben a találmány szerinti eljárás során alkalmazott lipáz típusú enzimek, részben pedi^. a 1.937.678. sz. NSZK-beli közzétételi iratban fellelhető enzimek: 10 mg (dl) PGE, - metilészter ; és 10 mg különböző eredetű (a 3. minta esetében enzimrendszert) enzimet tartalmazó mintákat 1,5%-os etanolos (pH=7,5) pufferben 125 percig 25° C-on nitrogén atmoszférában reagáltattunk. A minták jelzése: 1.) Bacillus subtilis neutrális proteáz, 2.) Bacillus subtilis alkalikus proteáz, 3.) Streptomyces fradiae proteáz, 4.) Rhizópus extracelluláris lipáz, 5.) Sertés pancreas lipáz, 6.) Nagase „Saiken" A lipáz, 7.) Kimotripszin, 8.) minta enzim nélkül. Azt találtuk, hogy az alkalmazott enzimek közül csak a lipázok hatásosak) l.ábra4,5,6 sz. minta, PGE,-metil-észter Rf=0,4: PGE, -szabad sav Rf=0,19), holott irodalmi tény,hogy mikróbiális eredetű proteázok rendelkeznek észteráz aktivitással (The Enzymes, ed. P. Boyer and Myrb'áck, il. kötet, Proteolytic Fn7vmes). Az elbontandó észter az I., II., III., IV., általános képletek valamelyikével jellemezhető, mely képletekben R jelentése -(CH2 ) é -COOR, gyök, vagy -CH 2 -(CH=CH)-(CH2 ) 3 -COOR, gyök és térállása vagy a, vagy 0, és R, jelentése 1-4 szénatomot tartalmazó alkilcsoport. Az I. képlethez tartozó vegyületek elnevezése PGE; ha R jelentése -(CH,)4 -COOR,, akkor PGE,, ha -CH 2 -(CH=CH)-(CH3 ),- COOR,, akkor PGE,. Hasonlóképpen a (II) képletű vegyületek a PGA, és PGA,, a (III) képletű vegyületek a PGB, és PGB,, a (IV) képletű vegyületek a PGF,, és PGF,( ül. az utóbbi a és <J változatai a 9-)H térállása szerint) -, néven szerepelnek a továbbiakban. A prosztaglandinok alifás észtereit kémiai totálszintézissel állítjuk elő. Az intermedierek és végtermékek azonosítása vékonyrétegkromatográfiával, tömegspektrográfiás-, infra-, NMR-, gázkromatográfiás- mérésekkel történik. Ezen mérések eredményei az irodalomban már ismertetett adatokkal azonosak. Eljárásunkat előnyösen az alábbiak , szerint foganatosítjuk: Az anyagát vizes szuszpenzióban pH kontroll alatt szobahőmérsékleten nitrogénáramban vagy argonáramban karboxiészter-hidroláz hatású enzimkészítménnyel hidrolizáljuk. A hidrolízist vékonyrétegkromatográfiával, illetve automatikus lúgadagolással követjük. A hidrolízis befejezése után a reakcióelegyet vízzel nem elegyedő oldószerrel extraháljuk a szennyezések eltávolítására. A vizes fázist kén savval pH = 3,5-3,0- értékre savanyítjuk, és az így felszabadított prosztaglandin szabad savakat vízzel nem elegyedő szerves oldószerben rázzuk át. A szerves fázist víztelenítjük, bepároljuk és a maradékot megfelelő oldószerből átkristályosítjuk. Közismert, hogy a PGE- származékok-vizes oldatban csak pH=3 és pH=8 között stabüisak, pH=2 alatt PGA es pH=8 fölött irreverzibilisen PGB származékokká alakulnak át. Ezért az észterhidrolízist az adott pH határokon belül, ül. gyakore latilag semleges pH mellett kell végezni. A találmány tárgyát képező eljárást célszerűen az ismert un. pH-sztátban végezzük el, melynél egy érzékeny pH mérő két elektródja a reakcióedénybe merül, melyben a hidrolízist végezzük. A szubsztrátum és az enzim vizes oldatának 10 bemérése után automatikus bürettából megfelelő töménységű nátriumhidroxiddal a pH-t tetszés szerinti pH értékre állítjuk, (pl. pH = 7,40). Ezután a gép automatikusan - a hidrolízis Ütemének megfelelően - a felszabaduló savat közömbösíti, úgy, hogy a pH-t az előre beállított (pH = 7,40) értéken tartja. A lúgfogyast az idő függvényében irómű regisztrálja. A hidrolízis befejezését az automatikus lúgadagolás megszűnése jelzi. Az elméleti lúgfogyástól való eltérés - a prosztaglandinok pK-értékének figyelembevételével - az anyag 2o tisztaságát is jelzi az adott reakciókörülmények közt. Az eljárás a szubsztrátumok hatóanyag-tisztaságának megállapítására is alkalmazható. A hidrolízis pH-értékének megválasztásánál figvelembe vesszük az enzim működésének pH - optimumát, a prosz-25 tagiandin- származék pK értékét és pH stabilitását. Eljárásunk preparatív . jellegű felhasználás mellett előnyösen alkalmazható pl. prosztaglandinok elválasztására is. A prosztaglandinok anyagkeverékét ismert eljárás szerint diazometánnal metilezzük, majd a prosztaglandin-metü-30 észtereket kromatografáljuk [J. Chromatog. 48/1970/ 542-544] és az egyes metiésztereket enzimes eljárásunkkal kvantitatíve savvá alakítjuk vissza. Az eljárás során az enzimet megfelelő szilárd hordozón is alkalmazhatjuk, mikoris a folyamat folytonossá tehető az 35 enzim regenerálásával. Szüárd enzimkészítmények néhány előállítási lehetősége: -a) diazotált poliaminostirollal térhálósítást végzünk; b) CM-Cellulose- hoz, vagy CM-Sephadex-hcz kapcsoljuk az enzimet, úgy, hogy a cellulóz-származékot előzőleg 40 savaziddá alakítjuk; c) poliakrilamid gél kapszulákba zárjuk be az enzimet. -Eljárásunk részleteit a példákban ismertetjük: 45 Példák 1) Az alábbi két oldatot készítjük elő: A) 20 mg (5,4.10"s mol) természetes 1-PGE, metilésztert 60 (melyet természetes 1-PGL,- bői diazometanos reakció újtán kaptunk) feloldunk 0,4 ml 95%-os etanolban és 15 ml desztillált vizet adunk hozzá. Az emulziót óvatosan pH 7,40 értékre állítjuk és 15 percig nitrogént buborékoltatunk át rajta (az elnyelt széndioxid kiűzésére. 56 B) 20 mg Nagase „Saiken" Lipaze A-t (melynek aktuális aktivitása 650 Desnvelle egység) feloldunk 5 ml desztillált vízben, a pH-t 7,40 értékre állítjuk. 30 percig kevertetjük szobahőmérsékleten. A hidrolízist 0,01 n nátriumhidroxiddal követjük pH -60 7,40-en, az A és B oldatot pH-sztát rendszerbe helyezve nitrogén-áramban. 25+1 C°-on. A reakció lefutását a lúgfogyás befejeződése illetve az elméleti lúgfogyás megközelítése jelzi. Vékonyrétegkromatográfiásan, - az automatikus lúgadagolás leállása után, - észternyomok nem mutat-65 hatók ki. Ez egyben a hidrolízis végét is jelenti. A lúgfogyás: 5.3 ml 0,01 n nátriumhidroxid. A PGE,-sav pK értékét figyelembevéve (elméleti fogyás 5.4 ml) az elért hidrolízis hatásfoka 98%. Reakcióidő: 30 perc. A reakció lefutása után az elegyet 0-5 C° közé hűtjük és 70 0,1 n kensawal a pH-t 3,5 értékre állítjuk, ezután hideg etilacetáttal többször kirázzuk. Az etilacetátos fázist víztelenítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, a kivált kristályokat etilacetát-hexán keverékéből átkristályosítjuk. A kristályokat szárítjuk. Op: 114-115 C. 18,5 mg PGE,-savat 75 kapunk. Termelés: 92,5%. 2
