163848. lajstromszámú szabadalom • Eljárás prosztaglandinok előállítására
5 163848 6 Analízis: a) IR spektrum alapján: megegyezik a referens minta spektrumával: ^C = 0 1726, 1717 cm-'; 5 transz kettős kötés 980 cm—1 . b) Vékonyréteg kromatográfiás mobilitás (Kieselgel G-n réteg, futtató dioxán:benzol:ecetsav = 20:20:1): 10 referens PGE, :Rf = 0,62; kapott termék : Rf = 0,62. c) A biológiai aktivitás megegyezik az eredeti PGE, mintával (tengeri malac ileum kontrakciós teszttel mérve). 15 2) Az alábbi 2 oldatot készítjük elő: A) 129,6 mg (3,5.10-4 mol) szintetikus dl-PGE, metilésztert, amelynek a tisztasága 90%-os, feloldunk, 1,3 ml 95%-os etanolban, és 30 ml desztillált vizet adunk hozzá. A pH-t óvatosan 7,40 értékre állítjuk, 15 perces nitrogén 20 öblítést végzünk. B) 150 mg Nagase „Saiken" Lipase A-t (aktuális aktivitás 4875 Desnuelle egység) 20 ml desztillált vízben oldunk, a pH értéket 7,40-re állítjuk, 30 percig kevertetjük. Mint az 1. példában, 0,03 n nátriumhidroxiddal követjük 25 a hidrolízist. Nátriumhidroxid fogyás: 10,5 ml (elméleti fogyás 11.66 ml). Elért hidrolízis-hatásfok 89%. Figyelembevéve a kiindulási anyag hatóértékét, a reakció kvantitatívnak tekinthető. A reakciót nitrogénáramban végeztük. Reakcióidő- 180 perc. Vékonyrétegkromatográfiásan követve a reak- 30 ciót cszternyomok nem mutathatók ki. A reakcióelegyet lehűtjük 0-5 C° közé. A szennyeződések eltávolítására 1x15 ml, majd 2x10 ml hideg éterrel kirázzuk. Az éteres fázist bepároljuk, a kapott szennyezés súlya 14 mg, 10,8% a kündulási anyagra vonatkoztatva. 35 A lehűtött vizes fázist 0,3 n kénsawal pH = 3,5 értékre savanyítjuk. Hideg etilacetáttal (1x25 ml, 2x20 ml 1x10 ml) kirázzuk. (Vékonyrétegkromatográfiás analízis alapján, a vizes fázisból a PGE,-sav kvantitatív átoldódik az etilacetátba). Az etilacetatos fázist víztelenítjük, csökkentett nyomáson 40 bepároljuk, a kivált szilárd kristályokat etilacetát-hexán keverékből átkristályosítjuk, szárítjuk. 105 mg dl-PGE, savat kapunk (81,5%). Op: 114-115 C°. Termelés a hatóanyagra számolva 90,5%. 45 Analízis. a) Az IR spektrum alapján egyezik a természetes PGE, IR spektrumával: ^>r=0 1726 1717 cm-1 50 trans kettős kötés 980 cm"l b) A termek vekonyretegkromatográfiás analizis alapján egységesnek tekinthető, további tisztítást nem igényel. A futtató rendszer olyan, mint az 1. példában. Referens PGE,: Rf=0,62 55 a kapott termék PGE,: Rf=0,62. c) A biológiai aktivitás a hibahatárokon belül a standard mintával azonos: ED5 0 = 0,087 jug-3 ) Az alábbi két oldatot készítjük elő: A.) 13,6 mg (3,7.10-5 mól) dl-PGE, metilésztert (90%-os) 0,3 60 mi 'i>t<i\ etanolban oldunk és 7 ml desztillált vizet adunk hozzá. Az emulzió-pH-ját 7,40 értékre állítjuk, 15 perces nitrogen öblítést végzünk. B.)13 mg pankreas lipázt (260 Desnuelle egység aktuális aktivitású) 7 ml desztillált vízben oldunk, pH=7,40 értékre 65 állítjuk. A hidrolízist 0,01 n nátriumhidroxiddal követjük nitrogénáramban 25±1 C°-on. Mért nátriumhidroxid fogyás 3 ml (elméleti 3,7 ml). Hatásfok 81 %. a kiindulási észteT hatóanyagtartalmát figyelembevéve 90%. Reakcióidő: 80 perc. A reakcióelegyet lehűtjük 0-5 C° közé és a továbbiakban úgy járunk el, mint a 2. példában (éteres kirázás: 1x50 m, 2x3,0 ml). Éteres fázis bepárolva: a szennyezés súlya 2,0 mg, 14,5%, a kiindulási anyagra vonatkoztatva. 75 A lehűtött vizes fázist 0,1 n kénsawal pH=3,5 értékre savanyítjuk, hideg etilacetáttal kirázzuk, szárítjuk (1x5 ml, 3x30 ml) és bepároljuk. A kivált anyagot etÜacetát-hexán keverékéből kristályosítjuk, szárítjuk. Op: 114-115 C°, súly: 10,2 mg 75%. Akiindulási észter hatóanyagára számított hozam: 85%. Analizis: Az analízis eredményei megegyeznek az 1. példában és a 2. példában kapott termék analízis eredményeivel. 4.) Az alábbi két oldatot készítjük elő: A.) 20 mg (5,4.10-5) szintetikus dl-8-izo-PGE, -metilésztert leioldunk 0,3 mi 95% etanolban és hozzáadunk 10 ml desztillált vizet. A képződött emulziót pH=7.40 értékre állítjuk, 15 percig nitrogénárammal öblítjük. B.) 20 mg Nagase „Saiken" Lipase A-t aktuális (aktuális aktivitás 650 Desnuelle egység) 5 ml desztillált vízben oldunk és az elegyet pH=7,40 értékre állítjuk 30 perces keveréssel. A reakció kivitelezésmódja azonos a 2. példában leírtakkal. A reakció lefutását 0,01 n nátriumhidroxid automatikus adagolásával követtük nátriumhidroxid fogyás 4,32 ml (elméleti 5,4 ml). A hidrolízis hatásfoka 80%. Reakcióidő: 70 perc. A feldolgozás módja azonos, az 1. és 2. példákban leírtakkal. Az etilacetatos fázis (vékonyrétegkromatográfiás analízis alapján (dl-8-izo-PGE,-et tartalmaz. Termelés: 15 mg, 75%. Op: 101-102 C°. Analízis A termék tömegspektruma, IR spektruma, és vékonyréteg kromatográfiai mobilitása . megegyezik a természetes izomerével. 5.) Az alábbi két oldatot készítjük elő: A.) 40 mg (10,8-10-5, mól) szintetikus dl-PGE, metilésztert 0,4 ml 95'/^os etanolban oldunk és 20 ml desztillált vizet adunk hozzá, a képződött emulziót pH=7,40 értékre állítjuk, 15 percig nitrogénárammal öblítjük. B.) 40 mg Nagase „Saiken" Lipase A-t (aktuális aktivitás 1 300 Desnuelle egység) 20 ml desztillált vízben pH=7,40 értékre állítva 30 percig keverünk. A reakció lefutását 0,01 n nátriumhidroxiddal követjük, a pH-t 7,40 értékre állítjuk. Hatásfok: 82%>. Reakcióidő 120 perc. A reakcióelegyet 0-5 C° közé hűtjük. 0,1 n kénsawal pH=3,5 értékre savanyítjuk, majd 1x20, 3x10 ml etilacetáttal kirázzuk, az etilacetatos fázist bepároljuk, a kivált kristályokat etilacetát hexánkeverékéből átkristályosítjuk. A kivált színtelen kristályokat szárítjuk, op: 64,5-66 C°. Termelés: 32,3 mg, 81%. Analízis: Vékonyrétegkromatográfiás mobilitás: referens PGE, : Rf= 0,62: kapott termék PGE2 : Rf=0,62. Futtató: benzol: dioxán: ecetsav=20:20:l, 6.) Az alábbi két oldatot készítjük elő: A.) 30 mg (8,35.10-5 mól) szintetikus dl-PGF,a metilésztert (eloldunk 0,2 ml 95% etanolban és 15 ml desztillált vizet adunk hozzá, a pH-t 7,40 értékre állítjuk, nitrogénárammal öblítjük. B.) 30 mg Nagase „Saiken" Lipase A-t (aktuális aktivitás 975 Desnuelle egység) feloldunk a már fent leirt módon 8 ml desztillált vízben. A hidrolízist az 1. és 2. példa szerint végezzük. 0,01 n nátriumhidroxid fogyás 7,5 ml (elméleti 8,35 ml) hatásfok 89%. Reakcióidő 90 perc. A továbbiakat az 5. példa szerint végezzük. Keletkezett termék: 23 mg, 76%, op: 102-103 C°. Analízis: Vékonyrétegkromatográfiás > mozgékonyság alapján: Keletkezett termék: Rf=0,45: referens minta: Rl=0,45 az 5. példában megadott futtató elegyben. 7 ) A fenti példákban leírtakkal azonosan járunk el. 20 mg (5,3.10"5 mól) dl-PGA, megtilésztert a fent említett módon feloldunk (0,2 ml etanol • 15 ml víz) 20 ml Nagase „Saiken" Lipase A-t (aktuális aktivitás 650 Desnuelle egység) a fentiekben leírt módon oldunk: nitrogénárammal öblítjük. 3
