163770. lajstromszámú szabadalom • Eljárás metilkobalamin előállítására
163770 3 4 kobalamin részt vesz a metionin bioszintézisével kapcsolatos anabolikus folyamatokban. A metilkobalamint eddig a Co — Y kobalaminok, pontosabban, a hidroxokobalamin redukciójával, és a redukált vegyület és egy kationképző alkilezőszer reakciójával állították elő. Ezt a reakciósorozatot a csatolt reakcióvázlaton szemléltetjük, ahol a hidroxi csoportot Y-nal, a kationképző alkilezőszert R+ jellel, az elektront e - jellel szimbolizáljuk, és a redukciót mint elektronfelvételt értelmezzük. Ezt az eljárást az 1 450 375 sz. francia szabadalmi leírás és az 1 213 842 sz. NSZK-beli szabadalmi leírás ismerteti. F. Wagner és K. Bernhauer [Ann. N. Y. Acad. Sei. (1964) 580-589. oldal] leírta, hogy a corrinvázas vegyületek kobaltatomja alkil-anionnal alkilezhető. Az említett szerzők a dicianokobirinsav heptaetilészterének kobaltatomját metilezték, metil-magnézium-jodiddal és metil-lítiummal, oldószerként éter-tetrahidrofurán elegyet használtak. Meg kell jegyeznünk, hogy a dicianokobirinsav heptaetilésztere szerves oldószerekben, így étertetrahidrofurán elegyben oldható, ezért Wagner és Bernhauer igen erősen reakcióképes fémorganikus vegyületeket, így egy magnéziumszármazékot és egy lítiumszármazékot használt a reakcióhoz. Az általuk leírt reakció során azonban nemcsak a kobalt alkileződik, hanem, mint megfigyelték, a molekula észtercsoportjai is részt vesznek a reakcióban, és tercier alkohol-csoporttá alakulnak. Ismeretes, hogy a fémorganikus vegyületek igen reaktívak és szerves vegyületek számos funkciós csoportjával reagálnak. A Bi2-vitamin és származékai komplex molekulájú vegyületek, amelyekben számos olyan centrum van, amelyet a fémorganikus vagy elemorganikus vegyületek megtámadhatnak. A Wagner és Bernhauer által ismertetett fémorganikus vegyületek tehát nem használhatók kobalaminok szelektív alkilezésére. Azok a kobalaminok, melyekben a kobaltatomhoz hidroxi-, szulfit-, ciano-, ciomát-, tiociamát — vagy nitritcsoport, halogénatom vagy egy 5'-dezoxi-adenozil-típusú csoport kapcsolódik, ezenfelül csak vízben és rövid szénláncú alkoholokban oldódnak, amelyekben a Wagner és Bernhauer által leírt fémorganikus vegyületeket nem használhatjuk reagensként, minthogy az oldószer elbontaná őket. A találmány célja, hogy az ismert eljárásnál egyszerűbb egylépéses eljárást biztosítson metilkobalamin előállítására. Azt találtuk, hogy egyszerűen, egy lépésben állíthatunk elő metilkobalamint oly módon, hogy jódkobalamint, hidroxokobalamint vagy 5'-dezoxiadenozil-5,6-dimetü-enzimidazol-kobalamint metil-higany-halogeniddel vagy ammónium-met ihexafluorszilikáttal a kobaltatomon szelektíven metilezünk. A találmány szerinti eljárással a kobalaminok kobaltatomját szelektíven metilezhetjük, a molekula más reaktív centrumainak átalakulása nélkül. Ez a réakcióút az előbbiek ismeretében teljesen váratlan volt. Megjegyezzük, hogy a kobaltatom metilezésén azt értjük, hogy a kobaltatom és a metilcsoport között szén-kobalt kötést alakítunk ki. A találmány szerinti eljárás az eddigieknél egyszerűbb módon, egylépésben foganatosítható. A találmány szerinti reakciót oldatban vagy szuszpenzióban végezhetjük. 5 A kobalamin oldószereként elsősorban vizet vagy rövidszénláncú alkanolokat, előnyösen metanolt és etanolt használunk. A kiindulási kobalamin kobaltatomjának szelektív metilezéséhez kiválasztott fémorganikus vagy 10 elemorganikus vegyületek vízben vagy rövidszénláncú alkanolokban oldódnak és nem reagálnak ezekkel az oldószerekkel. Egy másik fontos szempont, hogy a kobalamin kobaltatomján levő szubsztituens a molekula más 15 funkciós csoportjainak károsodása nélkül hasadjon le. E feltételnek legjobban a fent említett reagensek felelnek meg. A találmány szerinti eljárásban reagensként használt ammónium-metil-hexafluoroszilikátot R. 20 Müller és munkatársai módszerével [Chem. Berichte, 98, 235, (1965) és 98, 241 (1965)] állíthatjuk elő. Ha a reakciót szuszpenzióban végezzük, olyan oldószert használunk, amely a reakciótermékekre 25 nézve közömbös, amelyben a reagensek oldhatók, és amelyek a kobalamint nem oldják. Ilyen oldószer pl. a hexán, a xilol és a metilénklorid. Ha a reagens könnyen oxidálható, akkor a reakciót közömbös gáz atmoszférában, pl. nitrogénben 30 hajtjuk végre. A reakció hőmérsékletét a reagens reaktivitásától és termikus stabilitásától függően választjuk meg. A reakciót a körülményektől függően a reakcióelegy hűtése vagy melegítése közben folytatjuk 35 le. A reakció hőmérséklete előnyösen 0 C° és 100 C° között változik. A találmány szerinti eljárással előállított metilkobalamint a Bi2-vitamin és származékainak kémiájában szokásos módszerekkel különítjük el. 40 így használhatunk pl. cellulózzal vagy módosított cellulózzal, mint karboximetil-cellulózzal vagy dietilaminocellulózzal töltött kromatografáló oszlopokat, vagy a vizes oldatból fenollal vagy fenol és egy klórozott oldószer elegyével extraháihatjuk vagy 45 acetonnal vagy más szerves oldószerrel való kicsapás útján különíthetjük el a terméket. Minthogy a kobalaminok általában fényérzékenyek és ugyanez mondható a fémorganikus és elemorganikus reagensre is, ajánlatos, hogy az extrak-50 ciós vagy elkülönítési műveleteket napfénytől vagy mesterséges fénytől védett helyen végezzük. A találmány szerinti eljárással előállított metilkobalamin anyagcserére kifejtett hatását patkányokon vizsgáltuk. Az állatokat etanollal mérgez-55 tük. Az állatok súlya a kísérletek elején 100 g volt. Az egyik kísérletsorozatban normális táplálékot, a másik sorozatban fehórjeszegény táplálékot adtunk az állatoknak. Az állatok súlygyarapodását összehasonlítottuk a kontroll állatok súlygyarapo-60 dásával. Vizsgálat normál táplálékkal Az állatokat 38 napig tápláltuk normális táplá-65 lékkal. A vizsgált állatoknak minden nap metil-2
