163672. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a kreatinin specifikus meghatározására - enzimes lebontás

163672 3 ződött kreatint vagy a kreatinin csökkenését önmagában ismert módon meghatározzuk. A leírásban alkalmazott enzim elnevezések megfelelnek az általánosan használt szisztematikus nómenklatúrának. Ezen enzimek mechanizmusa a következő: Kreatinináz=kreatininamidohidroláz: kreatinin + H2

0 ^ kreatin. Kreatináz—kreatinamidinohidroláz: kreatin 4- H2

0 ^ szarkozin + karbamid. Kreatin-kináz: kreatin+ATP ^ kreatinamidinofoszfát+ADP. Piruvátkináz: ADP 4- foszfoenolpiruvát ^ piroszőlősav+ +ATP. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott kreatininamidohidroláz enzimet oly módon állíthatjuk elő, hogy egy kreatinin-tartalmú közegben tenyésztett mikroorganizmust feltárásnak vetünk alá, a vízoldható feltárási frakcióból önmagában ismert módon, 7,0-nál magasabb pH-értéken biokémiai tisztítási, illetve frakcionálási módszerrel — egyidejűleg egy olyan próbát alkalmazva, amelynek segítségével a bevitt kreatininból képződött kreatint önmagában ismert módon meghatározzuk — a kreatinin-amidohidrolázt megtisztítjuk és végül adott esetben a jelenlevő kreatin-amidinohidroláz mellől ioncserélőkromatográfiás módszerrel elválasztjuk. Mint azt a fentiekben már leírtuk, a kreatininamidohidroláz enzim a kreatininnak kreatinná történő átalakulását katalizálja. Az ily módon képződött kreatint önmagában ismert módszerekkel közvetlenül mérhetjük, például kreatinkinázzal és adenozintrifoszfáttal (ATP) való foszforilálással adenozindifoszfát képződése közben, melyet önmagában ismert módon meghatározunk. Egy másik lehetőség abban áll, hogy a kreatinin csökkenését mérjük Jaffé szerint. A találmány szerinti eljárást előnyösen 7,8 és 8,3 közötti pH-értéknél hajtjuk végre. A pH-érték beállítására tetszés szerinti puffert alkalmazhatunk. Arra azonban ügyelnünk kell, hogy az alkalmazott puffer a kapcsolódó meghatározási módszert ne zavarja. Ha például a továbbiakban Jaffé módszerrel a kreatinin különbséget határozzuk meg, olyan puffert kell alkalmaznunk, mely a Jaffé-reakciót nem csökkenti. Kedvezőtlen lehet például a glicin-és glicil-glicil puffer; nem zavaró a foszfát- és pirofoszfát puffer. Abban az esetben, ha nem Jaffé szerint határozunk meg, hanem a kreatinkinázzal és az ATP-vel képződött kreatint határozzuk meg, ekkor glicinpuffert és hasonló puffereket is alkalmazhatunk. A találmány szerinti eljárásnál a minta előzetes fehérjementesítése nem szükséges. A fehérjementesítés azonban a kreatin képződését követő meghatározáshoz célszerű lehet. A találmány szerinti eljárás egyik különleges kivitelezési formája szerint a képződött kreatint kreatinamidinohidroláz enzimmel szarkozinná és kar-4 bamiddá alakítjuk át, és az utóbbit ismert módsz« rekkel meghatározzuk. A kreatin-amidinohidrolá enzimet az előzőkben a kreatininamidohidroláz ei zim előállítására leírt eljárás során állíthatjuk elő, 5 két enzimet ioncserélő kromatográfiás módszern szétválasztva. Ezen fenti eljárást előnyösen úgy végezhetjük e hogy egy kreatinamidinohidroláz és kreatininam dohidroláz keveréket tartalmazó enzim készítmém 10 alkalmazunk a meghatározáshoz. Ha a képződött kreatint önmagában ismert mc don kreatináz és ATP alkalmazása közben hat£ rozzuk meg, akkor a fehérjementesítés előnyös, m vei ezáltal a vizsgálat érzékenysége növekszik. Ez 15 nagyobb érzékenység azon alapszik, hogy fehérje mentesítés esetén koncentráltabb reakcióeleggy< dolgozhatunk és így az egy meghatározott kreat ninmennyiségre vonatkozó extinkciókülönbsége nagyobbak lesznek. 20 Egy kreatininamidohidrolázt és kreatinamidinc hidrolázt tartalmazó enzimkombináció alkalmazás akkor is előnyös lehet, ha a kreatinin meghatározás Jaffé szerint végezzük, mivel a kreatinamidinohidrc láz hatására az egyensúly a kreatin képződés in 25 nyába tolódik el. A találmány értelmében a kreatinin specifiku meghatározásához egy új reagenskombinációt ke szítunk. A találmány szerinti reagenskombináció 30 1. kreatinin-standardból, 2. pikrinsavból, 3. nátronlúgból, 4. kreatininamidohidrolázból 35 áll, egyedül vagy pufferrel, valamint adott esetbe kreatinázzal együtt, felhasználás előtt össze nei keverhető állapotban. Egy találmány szerinti további reagenskomb: náció 40 1. pufferből, mely redukált nikotinamid-adenir dinukleotidot (NADH), ATP-t és foszfoenolpirv vátot (PEP) tartalmaz, 45 2. laktátdehidrogenázból (LDH), piruvátkináz ból (PK) és MgCl2-ből, 3. kreatinkinázból (CK) és 4. kreatininamidohidrolázból 50 áll, felhasználás előtt össze nem keverhető állapol ban. A találmány szerinti eljárás és a találmány szerim 55 reagenskombináció első ízben ad lehetőséget a krea tinin specifikus meghatározásához, melyet a klinikE laboratóriumban rutinszerűen alkalmazhatunk é mely gyakorlati célokra különleges érzékenységgé bír. Az egyetlen idáig ismert Miller és Dubos-fél 60 specifikus meghatározási módszer viszont, rutin vizsgálathoz való alkalmazásra használhatatlan (ve R. J. Henry, Clinical Chemistry, 1964. 288. oldaf A következő példák megmagyarázzák a talál mány szerinti eljárást és a találmány szerinti vizs 65 gálati készítményeket. 2