163672. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a kreatinin specifikus meghatározására - enzimes lebontás
163672 5 1. példa 1,0—1,0 ml kreatinin-tartalmú mintát [szérumot 'agy hígított (1 + 50) vizeletet] és 0,5 ml 0,1 (0,05— 1,2) mólos, pH=8,0 pufferoldatot (különösen alkalnasak az alkálifémpirofoszfát- vagy alkálifémbszfátpufferek, kevésbé megfelelő a dietanolaminsósav vagy glicilglicin-sósav puffer) pipettázunk :ét (minta és vakpróba) centrifugacsőbe. A vak>róbához 0,5 ml, legalább 5 IU kreatininamidohidolázt (Boehringer készítmény 15 462 sz., 1972. őszöl forgalmazva) tartalmazó enzimoldatot, és legilább 0,8 IU, 0,02 mólos dietanolamin-pufferben pH = 8,2) oldott kreatinázt (Boehringer készítmény) tdunk. A mintához 0,5 ml ugyanilyen puffert pipetázunk. A reakcióelegyeket ezután 37 C°-on 45—60 >ercig inkubáljuk, majd mindkét reakcióelegyből ,0 ml 3 n triklórecetsavoldat hozzáadásával kisapjuk a fehérjét, és lecentrifugáljuk. Jaffé módszere szerint a minta és a vakpróba ,5 ml felülúszójához 0,5 ml 43 mmólos vizes pikrinavoldatot és 0,5 ml 4,1 mólos nátriumhidroxidollatot adunk. 15 perces, szobahőmérsékleten történő tllás után a minta extinkcióját körülbelül 546 nm mllámhosszon a vakpróbával szemben leolvassuk. A minta kreatinin-tartalmának meghatározásáíoz előzőleg felvett kreatinin-standard görbét haszíálunk. Az 1. ábrán látható a lineáris összefüggés a kreainin mg%-értékek és az extinkcióértékek között. 2. példa A kreatin mérése kreatinkinázzal. Ennek a mérésnek elve abban áll, hogy kreatinn-amidohidroláz segítségével a kreatint kreatinná íidrolizáljuk, és a képződött kreatint M. L. Tänzer izerint (J. of Biol. Chem. 234, 3201 (1959)) kreatindnázzal és ATP-vel foszforizáljuk, a képződött \DP-t pedig foszfoenolpiruváttal (PEP) és piruvátdnázzal (PK) APT-vé alakítjuk át, és az így keletcező piruvátot NADH-al és laktátdehidrogenázzal aktáttá redukáljuk, NAD képződése közben. 1 mól ^JAD (334, 340 vagy 360 nm-nél mérve) megfelel 1 nól kreatinin jelenlétének. Az eljárás kivitelezéséhez 2,50 ml reagenst (mely £50 umól) glicilglicil-puffert, (pH—8,0), 1,0 umól STADH-t, 2,75 umól ATP-t, 30, umól PEP-t és 75 imól MgCl2 -t tartalmaz (0,02 ml enzimoldattal ke/erünk, mely legalább 1 ug sertésizomlaktát-dehid•ogenázt (LDH) (Boehringer készítmény, 15 272 sz.) ;s legalább 10 ug piruvát-kinázt (PK) (Boehringer cészítmény, 15 744. sz.) tartalmaz, és az elegyhez ),06 ml, legalább 0,5 mg kreatinkinázt (Boehringer íészítmény, 15 334 sz.) tartalmazó kreatininkinázol-Jatot adunk. Az elegyhez 0,5 ml kreatinin-tartalmú riintát adunk, az elegyet 10—15 percig 30C°-on nkubáljuk, majd a mérést 0,02 ml, 50%-os gliceriníel készített kreatininamidohidroláz-oldat (mely legilább 4 IU Boehringer kreatinináz-készítményt, 15 462 sz. tartalmaz) hozzáadásával kezdjük meg. Az extinkciót a hozzáadás után közvetlenül mérük 340 és 366 nm hullámhosszon (Ex), majd 30 perces 30 C°-on történő inkubálás után mérjük az E2 írtéket. További 10 perc múlva (ugyancsak 30 C°-os inkubálás után) olvassuk le az E3 értéket. Ha az E 3 6 különbözik az E2 -től, extrapolálást végzünk. A számítást a következőképpen végezzük: /tE=(E1 -E 2 )-3x(E 2 -E 3 ) 5 mg% kreatinin = AEXössztérfogatXmólsúly 100 _ .. . eXl mintatérfogat 100 ~ 10 (e=extinkciós koefficiens) A mellékelt rajz 2. ábráján a fenti mérés standard görbéje látható. Ennek az eljárási módnak az előnye az, hogy a 15 Jaffé módszerhez képest kb. tízszeres mennyiségű vizsgálati anyagot takarítunk meg, nem szükséges a szérum vakpróbáját elkészíteni, sem fehérjementesítésre, sem centrifugálásra nincs szükség. 20 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás kreatinin specifikus meghatározásra azzal jellemezve, hogy egy kreatinin tartalmú vi-25 zes oldatot kb. 7,5 és 9 közötti pH-értéknél kreatininamidohidrolázzal inkubálunk és a képződött kreatint vagy a kreatinin mennyiségének csökkenését önmagában ismert módszerrel meghatározzuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 30 módja, azzal jellemezve, hogy foszfát- vagy pirofoszfát puffert alkalmazunk és a kreatinin-különbséget a pikrinsav és nátriumhidroxid hatására képződött színintenzitás-különbség mérésével határozzuk meg. 35 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a képződött kreatint kreatinkinázzal és ATP-vel foszforizáljuk és a képződött ADP-t önmagában ismert módon megmatározzuk. 40 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a képződött kreatint kreatinamidinohidroláz jelenlétében hidrolizáljuk és a képződött karbamidot ismert módszerekkel meghatározzuk. 45 5. A 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kreatinamidinohidrolázzal végzett reakciót 7,8—8,3 közötti pH-nál hajtjuk végre. 6. A 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 50 módja, azzal jellemezve, hogy a meghatározandó mintát a kreatinnak kreatinkináz alkalmazásával történő mérése előtt fehérjementesítjük. 7. A 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kreatininamido-55 hidrolázt a kreatinamidinohidrolázzal együtt adagoljuk. 8. Reagenskészítmény a kreatinin specifikus meghatározására, azzal jellemezve, hogy az 60 1. kreatinin-standardból, 1 mg/100 ml híg sósavas oldatként, 2. 43 mmólos vizes pikrinsavoldatból, 3. 4,1 n nátriumhidroxidoldatból, 4. kreatininamidohidrolázból, önmagában vagy 65 pufferrel, 3
