163588. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 7béta- (D-5-amino-5-karboxi-valeramido) -3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-CEF-3-AM-4-karbonsav antibiotikum előállítására
163588 23 24 musok (Gram-negatív baktériumok) fejlődését: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Alcaligenes faecalis, Brucella bronchiseptica, Salmonella gallinarum, Vibrio percolans és Xanthomonas vesicatoria. Gátolja továbbá Gram-pozitív baktériumok közül a Staphylococcus aureus, Sarcina lutea és Bacillus subtilis fejlődését. In vivo kísérletekben egéren a 842A antibiotikum az alábbi hatásokat mutatja: szubkután injekcióban történő beadás esetén az alább megadott adagok szükségesek az egerek 50%-ának megvédésére az alább felsorolt mikroorganizmusokkal történő, egyébként letalis kimenetelű fertőzéssel szemben (ED50-érték): LD60 kétszeri szubkután beadás esetén Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morganii 3202 Salmonella schottmuelleri Klebsiella pneumoniae AD Klebsiella pneumoniae B Paracolobactrum arizoniae Escherichia coli Aerobacter aerogenes Pasteurella multocida Salmonella typhosa Diplococcus pneumoniae E400 51 mcg 276 mcg 276 mcg 103 mcg 125 mcg 125 mcg 125 mcg 200 mcg 49 mcg 57 mcg 34 mcg 566 mcg Megjegyzés: a fenti felsorolásban szereplő Proteus morganii 3202 törzzsel való fertőzéssel szemben a cefaloridin és a cefalotin kétszeri 4000 mg adagban nem nyújtott védelmet. A fent ismertetett in vivo kísérleteken kívül végeztünk egéren kísérleteket a fent leírttal egyező módon egy a cefalosporinokkal szemben rezisztens és a C-cefalosprin lebontására képes, klinikailag elkülönített Proteus morganii 356 törzzsel is; ennek során az alábbi ED60-értékeket kaptuk: Fertőző mikroorganizmus Proteus morganii 356 842A Proteus morganii 356 cefalotin Proteus morganii 356 cefaloridin 10 15 20 25 35 40 Antibiotikum ED80 kétszeri szubkután adag esetén (két ki- ._ sérlet átlaga) 374 mcg 20 000 mcg 50 9 270 mcg 2. példa 55 A 842 A antibiotikum előállítása rázópalackos fermentáció útján Pa. inokulumot az 1. példában leírt módon készítjük el. A második lépésben kapott rázópalackos 60 kultúrákat egyesítjük és inokulumként használjuk fel 62 darab, egyenként 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50—50 ml X. tápközeg beoltására. Lombikonként 1 ml inokulumot alkalmazunk. A X. tápközeg összetétele: 65 X. tápközeg: szójaliszt (Staley 4S) 30,0 g Cerelose 20,0 g cefre-sűrítmény 7,5 g nátriumklorid 2,5 g kalciumkarbonát a (pH 7,0-ra állítása után) 10,0 g desztillált víz 1000,0 ml A lombikokat egy 5 cm löketű rázókészüléken 5 napig rázatjuk percenként 220 fordulattal, 28 C° hőmérsékleten. Az inkubáltatás befejeztével 60 ilyen lombik tartalmát egyesítjük és a fementlé egy mintájából a micéliumot centrifugálással eltávolítjuk. A centrifugált fermentleben biológiai értékméréssel határozzuk meg a jelenlevő 842A antibiotikum mennyiségét, az ismert korongos ágár-dififúziós módszerrel; 1,2 cm átmérőjű szűrőpapír-korongokat itatunk át a fermentlé mintájával és a papírkorongot a Vibrio percolans MB—1272 törzsszel beoltott ágár-lemezre helyezzük. 4 napig inkubáltatás után 33 mm átmérőjű gátlási zónát kapunk. 3. példa A 842A antibiotikum előállítása fermentáció útján. 30 1. lépés: Egy liofilizált Streptomyces lactamdurans MA— 2908 kultúrát tartalmazó kémcső tartalmával beoltunk egy bedugaszolt 200 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml steril V. tápközeget; ennek összetétele : V. tápközeg: élesztő-autolizátum (Ardamine) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfát-pufferoldat 2,0 g MgS04 .7H 2 0 0,05 g desztillált víz 1000,0 ml pH-érték nátriumhidroxiddal 6,5-re állítva. A foszfát-pufferoldat összetétele: KH2 P0 4 91,0 g Na2 HP0 4 95,0 g desztillált víz 1000,0 ml. A beoltott lombikokat egy 5 cm löketű, percenként 220 fordulattal működtetett rázókészüléken 72 óra hosszat inkubáltatjuk 28 C° hőmérsékleten. 2. lépés: Az 1. lépésben kapott rázott kultúra 10,0 ml-jével beoltunk egy kétliteres bedugaszolt Erlenmeyerlombikban levő 50 ml sterilizált V. tápközeget (összetételét 1. lentebb). A beoltott lombikot egy percenként 220 fordulattal működtetett rázókészülékben 48 óra hosszat inkubáljuk 28 C° hőmérsékleten. 12
