163588. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 7béta- (D-5-amino-5-karboxi-valeramido) -3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-CEF-3-AM-4-karbonsav antibiotikum előállítására

163588 25 3. lépés: A 2. lépés szerint kapott rázott kultúrával egy 230 literes rozsdamentes acél fermentorban levő 160 liter V. tápközeget (összetételét 1. fentebb) oltunk be. A beoltott tápközeget 28 C° hőmérsékleten 48 óra hosszat inkubáljuk levegőztetés (percenkint 85 liter légárammal) közben. A fermentáció folyamán a túlságos habzás gátlására időnként kismennyiségű „pohglikol 2000" habzásgátló szert adunk a fementációs léhez. 4. lépés: A 3. lépésben kapott kultúra 43 literjével beoltunk egy 900 literes rozsdamentes acél fermentorban levő 467 liter steril XII. tápközeget, amelynek összetétele az alábbi: XII. tápközeg: Élesztő (Amber 300) 10,0 g cefresűrítmény 20,0 g desztillált víz 1000,0 ml pH = 7,0 A fermentációt 28 C° hőmérsékleten, keverés és levegőztetetés (percenkint 280 liter légárammal) közben 72 óra hosszat folytatjuk. A fermentáció folyamán a túlzott habzás gátlására „pohglikol 2000" habzásgátló szert adunk csekély mennyiségekben a közeghez. A fermentáció befejeztével a fermentlé abtibiotikum-aktivitását biológiai értékméréssel, korongos módszerrel vizsgáljuk. A fermentációs levet diatomaföld-rétegen keresztül szűrjük 7,8 pH-értéknél. A biológiai értékmérés során Vibrio percolans MB—2172 mikroorganizmussal szemben az 1:10 hígítása fermentációs lé 21,5 mm átmérőjű gátlási zónát ad. 4. példa A termék tisztítása; a 7ß-(D-5-amino-5-karboxi-valeramido) -3- (karbamoiloximetil) -7-metoxicef-3-em-4-karbonsavmononátriumsójának elkülönítése. Adszorbeáltatás aktívszénen: A 8. példában leírt módon lefolytatott négy fermentációs művelet termékét 100 ml térfogatú erősen bázisos anioncserélő gyantaágyon (sztirol-divinilbenzol alapú Dowex 1X2 gyanta, kloridciklusban) adszorbeáltattuk, majd a gyantaágyat 1%-os vizes nátriumklorid-oldattal eluáltuk, az eluátumot 50 ml térfogatú frakciókban fogtuk fel és a frakciók biológiai aktivitását mértük. Az így előkészített eluátumfrakciók további feldolgozása a következő módon történik: Az eluátum-frakciókat (mind a négy fermentációs műveletből) 5 pH-értékre állítjuk híg sósavval, majd egyesítjük ezeket a frakciókat. Ilymódon 4300 ml térfogatú oldatot kapunk. Ebből az oldatból 4200 ml mennyiséget 42 g aktívszén (Darco G—60) hozzáadásával 1/2 óra hosszat keverünk. Ezután az aktívszenet szűréssel elkülönítjük és vízzel mossuk. A szűrletet és a mosóvizet biológiai értékméréssel vizsgálva azt találjuk, hogy ezek nem mutatnak antibiotikum-aktivitást. A szűrőn maradt aktívszenet azután 60%-os vizes aceton 1—1 liter-26 jével kétszer eluáljuk olymódon, hogy az aktívszenet az eluáló folyadékkal 1/2 óra hosszat keverjük, majd leszűrjük. Az így kapott eluátumokat vákuumban betöményítjük; 108 ml ill. 100 ml térfogatú 5 koncentrátumot kapunk és ezt biológiai értékmérésnek vetjük alá. Ennek eredménye azt mutatja, hogy az első eluátum a termelt antibiotikum-aktivitás 76%-át tartalmazza, a kiinduló folyadéknál 18-szor nagyobb aktivitású; a második eluátum az 10 aktivitás 17%-át tartalmazza és 14-szer nagyobb aktivitású, mint a kiindulófolyadék. Az így kapott két koncentrátumot egyesítjük és további bepárlással 61 ml térfogatra töményítjük, majd 4—5 pH-értékre állítjuk híg nátriumhidroxid-oldat hozzá-15 adásával. Az így kezelt koncentrátum szárazanyagtartalma 40 mg/ml; 1:100 hígításban (400 mcg/ml) Vibrio percolans MB—1272 törzzsel szemben 25 mm átmérőjű gátlási zónát ad. A kapott terméket a 7/?-(D-5-amino-5-karboxi-20 valeramido)-3-(karbamoiloxmetil)-7-rnetoxi--cef-3-em-4-karbonsav (la) mononátrium-sójaként azonosítottuk. 5. példa 25 A termék tisztítása: a 7ß-(D-amino-5-karboxivaleramido) -3- (karbamoiloximetil) -7-metoxi-cef-3-em-4-karbonsav mononátriumsójának elkülönítése. 30 Adszorbeáltatás adszorbens-gélen: Az 1. példa B) lépésében kapott eluátum 22 ml mennyiségét híg nátriumhidroxid-oldattal 7,0 pH-értékre állítjuk, majd egy 388 ml BioGel P—2 ad-35 szorbenst tartalmazó oszlopon kromatografáljukt Az oszlopot vízzel hívjuk elő, a lefolyó folyadékodifferenciálás refraktométerrel vizsgáljuk; 5 ml tér. fogatú frakciókat fogunk fel önműködő készülék segítségével és e frakciókat biológiai értékmérés-40 nek vetjük alá. Az értékmérés azt mutatja, hogy a biológiai aktivitás a 47—63. frakcióban jelenik meg, míg a nátriumklorid a 62—72. frakcióban van. Az 50—60. frakciót egyesítjük, aktivitását újból mérjük, majd bepároljuk szárazra. Ilymódon 10,8 mg 45 maradékot kapunk, amelyet a a 7/?-(D-5-amino-5-karboxi-valeramido)-3-(karbamoiloximetil)-7--metoxi-cef-3-em-4-karbonsav mononátrium-sójaként azonosítottunk. Ez a termék a szokásos biológiai értékmérési módszerrel vizsgálva, 8 mcg/ml 50 koncentrációban 25 mm átmérőjű gátlási zónát mutatott Vibrio percolans mikroorganizmussal szemben. 6. példa 55 7ß- (D-5-amino-5-karboxivaleramido) -3- (karbamoiloximetil)-7-metoxi--cef-3-em-4-karbonsav előállítása. 60 Módosított fermentációs eljárás: A) Inokulum-készítés ferde agáron. Egy liofilizált Streptomyces lactandurans MA— 2908 kultúrát tartalmazó kémcsövet aszeptikus kö-65 rülmenyek között kinyitjuk és ennek tartalmát az 13