163588. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 7béta- (D-5-amino-5-karboxi-valeramido) -3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-CEF-3-AM-4-karbonsav antibiotikum előállítására
163588 21 IX. tápközeg: élesztőkivonat 10,0 g cefre-sűrítmény 20,0 g dextróz 10,0 g desztillált víz 1000,0 ml pH 7,0 Ezeket a termelő lobikokat 4 napig rázatjuk 28 C° hőmérsékleten, egy percenkint 145 fordulattal működtetett 5 cm löketű rázókészüléken. Az inkubáltatási időszak befejeztével 10 lombik tartalmát egyesítjük és a micéliumot centrifugálással eltávolítjuk egy kivett mintából. A fent leírt módon kapott fermentleben jelenlevő 842A antibiotikum, vagyis 7/?-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-cef-3-em-4-karbonsav mennyiségét biológiai értékméréssel határozzuk meg, a szokásos korongos ágár-diffúziós módszerrel, a fermentlével átitatott 1,2 cm átmérőjű szűrőpapír-korongok alkalmazásával, 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó 10 ml ágár-tápközeg lemezen, amelyet az értékmérésre alkalmazott mikroorganizmussal oltottunk be. A gátlási zónákat 28 C° hőmérsékleten éjjelen át történő inkubáltatás után mérjük. A 4 napi fermentáció útján kapott fermentációs lé ilyen módszerrel Vibrio percolans MB—1272 mikroorganizmussal szemben 31,5 mm átmérőjű gátlási zónákat mutatott. B) Adszorbeáltatás ioncserélő gyantán A fenti módon kapott és megszűrt fementlevet híg sósavval 7,0 pH-értékre állítjuk; 2900 ml levet egy 100 ml térfogatú erősen bázisos sztirol-divinilbenzol alapú anioncserélő gyantát (Dowex 1x2, klorid-ciklusban) tartalmazó ágyon vezetünk át percenkint 10 ml áramlási sebességgel. Az oszlopról lefolyó folyadékot 500 ml térfogatú frakciókban fogjuk fel. A gyanta-oszlopot azután vízzel mossuk és 90%-os metanolban oldott 3% ammóniumkloridot tartalmazó oldattal eluáljuk. Az eluátumot 100 ml térfogatú frakciókban fogjuk fel. Valamennyi felfogott frakciót biológiai értékméréssel vizsgáltunk Vibrio percolans (MB—1272) törzzsel szemben; a kapott gátlási zónák átmérőit az alábbi táblázat tartalmazza: Leszűrt fermetációslé Lefolyó oldat Eluátum-frakciók hígítás zona átm. mm Frakció Zóna Frakció Zóna 26,5 1. 0 1. 25 1:2 24 2. 16 2. 29 1:4 20 3. 23 3. 29 4. 25 4. 26,5 5. 27 5. 22 6. 27 8-6. 7. -10. 18 15 0 Ezek a vizsgálati eredmények azt mutatják, hogy az antibiotikum-aktivitás kb. 60%-a az oszlopról lefolyó oldatban, kb. 18%-a pedig az eluátumokban 22 jelenik meg. Továbbá azt is mutatják a vizsgálat eredmények, hogy a gyanta kapacitása csupán két frakcióra, vagy tízszeres oszlop-térfogatnak megfelelő mennyiségű fermentációs lére terjed ki. 5 Az elkutum 1—4. frakcióját egyesítjük és a metanolt elpárologtatjuk. Az oszlopról lefolyó oldat 3—6. frakcióját is egyesítjük; oly módon 1960 ml oldatot kapunk. Ebből 1860 ml-nyi rész pH-értékét híg nátriumhidroxid-oldattal 7,2 és 8,0 közöttire 10 állítjuk be, majd ezt az oldatot egy 100 ml erősen bázisos anioncserélő gyantát (sztiriol-divinilbenzol alapú Dowex 1x2 gyanta, klorid ciklusban) tartalmazó oszlopon adszorbeáltatjuk, percenkint 14 ml átáramoltatási sebességgel. Az oszlopról lefolyó 15 oldatot 4 egyenlő térfogatú frakcióban fogjuk fel; e frakciók biológiai értékmérése azt mutatja, hogy az antibiotikum-aktivitás 5%-a itt van jelen. Az oszlopot ezután vízzel mossuk és 5%-os vizes nátriumklorid-oldattal eluálunk. Az eluátumot 20 50 ml térfogatú frakciókban fogjuk fel és e frakciókat ugyancsak biológiai értékmérésnek vetjük alá. Az eredmények azt mutatják, hogy a termelt aktivitás 90%-a a kapott 3—16. frakcióban vaj jelen, így ezeket a frakciókat egyesítjük. 25 C) Adszorbeáltatás kationcserélő gyantán A B) műveletben kapott koncentrátum 50 ml térfogatú részét 500 ml -re hígítjuk, eredetileg 8,8 pH-értékét híg sósavval 2,0-ra állítjuk és az így 30 kapott oldatból a hatóanyagot egy 25 ml térfogatú, erősen savas szulfonát-típusú, sztirol-divinilbenzol alapú kationcserélő gyantán (Dowex 50x2, hidrogén-ciklusban) adszorbeáltatjuk, percenkint 2,5 ml átáramoltatási sebességgel. Az oszlopot ez-35 után 25 ml vízzel mossuk, majd 2% pridint tartalmazó vizes oldattal eluáljuk mindaddig, míg az oszlopról lefolyó eluátum pH-értéke 7-re nem emelkedik (54 ml eluátumot kapunk). Mind az oszlopról lefolyó eredeti oldatot, mind pedig az eluátumot 40 frakcionkint biológiai értékmérésnek vetjük alá; ennek eredményeiből kitűnik, hogy a termelt antibiotikum-aktivitás 9%-a az oszlopról lefolyó eredeti oldatban, 90%-a pedig az eluátumban jelenik meg. Az eluátumban jelenlevő hatóanyagot a 842A anti-45 biotikum pridinium-sójaként azonosítottuk. A termékként kapott 842A antibiotikum amforter jellegű vegyület, amelynek látszólagos izoelektromos pontja pH = 3,5 körül van. 7 feletti pH-értéken a termék instabil, 1,5 pH-értéken azonban 50 stabil. A kapott eluátumot híg nátriumhidroxid-oldattal 8,0 pH-értékre állítjuk be, majd a pridin eltávolítása céljából vákuumban bepároljuk. Maradékként a 842A antibiotikum mononátrium-sóját 55 kapjuk. Ennek molekulasúlya a C16 H 21 N 4 SO„Na tapasztalati képlet alapján 468. Elemzési adatok: számított: C41,0%, H4,5%, N 12,0%, S 6,8%, 60 0 30,8%, Na 4,9%; talált: C 39,31 %, H 4,76%, N 11,16%, S 6,46%, 034,12%. Na 4,19%. Ez a termék, tehát a 842A antibiotikum in vitro 65 vizsgálat során gátolja a következő mikroorganiz-11
