163454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás prosztaglandin-E2- előállítására
19 163454 20 (Skellysolve B) áll. A kapott frakciókat vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk, A-IX oldószer-rendszerrel; a 15-acetoxi-PGA2-metilésztert, 15-acetoxi-PGA 2 -t, PGA2 -metilészert, illetve szabad PGA 2 vegyületet tartalmazó frakciókat külön-külön egyesítjük; az így egyesített frakciók bepárlása útján kapjuk az említett termékeket. 5. előállítási előírás 15/?-PGA2 vegyületek kinyerése Plexaura homomalla (Esper) 1792 R-alakból. Florida Miamihoz közeli délkeleti partjainál levő zátonyokból gyűjtött Plexaura homomalla (Esper) 1792 R-alak kolóniáit 10 cm körüli nagyságú darabokra aprítjuk, majd szilárd széndioxiddal megfagyasztjuk a felaprított kolóniákat. A fagyasztásnak a kolóniák kiemelése után 1 órán belül kell megtörténnie. A megfagyasztott szilárd széndioxidot tartalmazó hőszigetelt dobozokban tartjuk, kb. — 20 °C alatti hőmérsékleten, egészen addig, amíg fel nem használjuk őket. A megfagyasztott kolónia-darabokat azután apróra őröljük (kb. 5 mm maximális szemcsenagyságúra); 1500 g ilyen őrleményt 23 liter diklórmetánnal 25 °C hőmérsékleten 20 percig keverünk nagyfordulatszámú keverővel. Ezután diatomaföld-rétegen keresztül leszűrjük és a szűrletet 30 °C hőmérsékleten, csökkentett nyomáson kb. 2 liter térfogatra bepároljuk. A kapott folyékony bepárlási maradékot vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfáttal szárítjuk, majd 30 °C hőmérsékleten, csökkentett nyomáson teljesen bepároljuk. 60 g fenti módon kapott olajszerű maradékot 3 kg szilikagélen kromatografálunk; a szilikagélt hexánnal (Skellysolve B) megnedvesített állapotban töltjük be az oszlopba. Az eluálást 4 liter hexánnal kezdjük, majd 4 liter 20% etilacetátot tartalmazó hexánnal folytatjuk, azután még 27 liter 20% etilacetátot tartalmazó hexánnal, 18 liter 50% etilacetátot tartalmazó hexánnal és 8 liter 75% etilacetátot tartalmazó hexánnal eluálunk (hexánként minden esetben Skellysolve B oldószert alkalmazunk). 600 ml-es frakciókat fogunk fel. A 39—60. frakciót egyesítjük és bepároljuk; ebből 24,3 g 15-acetoxi-15/?-PGA2 -metilésztert kapunk. A 50. és 74. frakció között azokat a frakciókat, amelyek a vékonyrétegkromatográfiai vizsgálat szerint 15-acetoxi-15/S-PGA2 -t tartalmaznak, egyesítjük és bepároljuk e vegyület kinyerése céljából. A 74—76. frakciót is egyesítjük és bepároljuk; ebből 1,03 g 15/?-PGA2 -metilésztert kapunk. A 83—91. frakciók egyesítése és bepárlása útján 1,08 g 15-acetoxi-15/?-PGE2 -metilésztert nyerünk ki. Még további frakciók tartalmazzák a 15/3-PGE2 -metilésztert; a vékonyréteg-kromatográfiai vizsgálat szerint e vegyületet tartalmazó frakciókat is egyesítjük és bepároljuk e vegyület kinyerése céljából. A vékonyréteg-kromatográfiai úton kimutatandó vegyületek kimutatását a szokásos módszerekkel végezzük, pl. oly módon, hogy a szóbanforgó frakciók mintáját szilikagél vékonyréteg-kromatográfiai lemezre visszük, az autentikus vegyületek mintáival együtt, majd a lemezt az A—IX oldószer-rendszerrel futtatjuk és megfigyeljük, hogy a vizsgált frakció által adott foltok melyike felel meg pontosan az autentikus vegyületek által adott foltoknak. Ha a fent leírt módon dolgozunk, de kiindulóanyagként a Plexaura homomalla (Esper) 1792 R-alak helyett Plexaura homomalla (Esper) 1792 S-alakot alkalmazunk, akkor a megfelelő, de 15(S) konfigurációjú vegyületeket, vagyis a 15-acetoxi-PGA2 -metilésztert, 15-acetoxi-PGA2 -t, PGA 2 -metilésztert, lS-acetoxi-PGEj-metil-5 észtert és PGE2 -metilésztert kapjuk. 6. előállítási előírás PGA2 és 5,6-transz-PGA 2 . 10 A PGA2 vegyületnek az 5,6-transz-PGA 2 vegyülettől való elválasztását ezüsttel telített ioncserélő gyantát tartalmazó kromatográfiai oszlopon végezzük. Előnyösen valamely makroretikuláris ioncserélő gyantát alkalmazunk erre a célra; jól megfelel pl. a 40—50 m2 /g faj-15 lagos felületű, 30—40 % pórusosságú, 4,5—5,0 milliekv./g (száraz gyantára számítva) teljes ioncserélő kapacitású szulfonált sztirol-divinilbenzol kopolimer gyanta, mint pl. az Amberlyst 15 (a Rohm & Haas Co., Philadelphia, gyártmánya). 20 A sav-alakban levő gyantát kromatográfiai oszlopba töltjük, meleg vízzel mossuk, majd ezüst-alakba hozzuk oly módon, hogy 10%-os ezüstnitrát-oldatot folyatunk keresztül az oszlopon mindaddig, míg az oszlop alján 25 kilépő folyadék 3,5—4,0 pH-értéket nem mutat. Az oszlopot ezután vízzel mossuk az ionos ezüst eltávolítása céljából, végül pedig denaturált etanollal (3A típusú denaturált etanolt alkalmazhatunk) mossuk át az oszlopot. Ezután rátöltjük az oszlopra a PGA2 és 5,6-30 -transz-PGA2 vegyületek elegyét tartalmazó oldatot (pl. a fenti 2. előállítási előírás szerint kapott 15—18. frakciót). „3A" alkohollal eluálunk; a kapott frakciókat az 5,6-transz-PGA2 , illetve PGA 2 tartalmuk szerint egyesítjük (az 5,6-transz-PGA2 eluálódik gyorsabban). 35 Az említett vegyületek jelenlétét az egyes frakciókban célszerűen vékonyréteg-kromatográfiai módszerrel mutatjuk ki, ezüstnitráttal kezelt szilikagél-lemezeken (pl. „Analtech Uniplates" lemezeken, amelyeket előzőleg telített, etanolos ezüstnitrát-oldatba mártottunk 40 és megszárítottunk); A—IX oldószer-rendszert alkalmazunk. A PGA2 R f -értéke e rendszerben 0,45; az 5,6--transz-PGA2 R f -értéke 0,50. Az egyesített frakciókat betöményítjük, diklórmetán és kevés víz között megoszlatjuk, a diklórmetános fázist elkülönítjük, vízmentes 45 nátriumszulfáttal szárítjuk, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. Ily módon elkülönített állapotban kapjuk a PGA2 , illetőleg 5,6-transz-PGA 2 vegyületeket. A PGA2 és 5,6-transz-PGA 2 vegyületek elegyeínek 5,6-transz-PGA2 tartalmát mennyiségileg egy kombinált 50 vékonyréteg-spektrofotometriai módszerrel határozhatjuk meg. Szilikagéllel impregnált mikro-üvegrost lapokat (pl. a Gelman Instrument Co., Ann Arbon, Michigan által gyártott „ITLC" lapokat) 5%-os etanolos ezüstnitrát-oldattal impregnálunk, majd megszárítjuk a lapo-55 kat. Ezután a PGA2 elegy 100—200 meg mintáiból foltokat viszünk a lapokra és 2,2,4-trimetilpentán-etilacetát-ecetsav-víz (100: 35: 8: 10, felső fázis) oldószerrendszerrel futtatjuk. A lapot azután megszárítjuk és „Rhodamine 6G" színezék (Applied Science Co., 60 State College, Pennsylvania) oldatával bepermetezzük. Az így előhívott foltot ibolyántúli fényben határozzuk meg; megjelöljük a cisz-, illetve transz-vegyületet tartalmazó foltokat (a PGA2 R f -értéke az említett oldószer-rendszerben 0,6; az 5,6-transz-PGA2 R f -értéke 0,7), 65 majd a megfelelő lap-részeket kivágjuk és 1,9 ml meta-10
