163273. lajstromszámú szabadalom • Eljárás urokináz-koncentrátumok előállítására emlősök vizeletéből
3 163273 4 A felsorolt előzmények alapján kitűnik, hogy bár számos eljárás ismert az urokináz kinyerésére vizeletből, ezek a módszerek nem minden vonatkozásban tekinthetők optimálisnak. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amely 5 kiküszöböli a korábbi eljárás hátrányos jellemvonásait és urokináz-koncentrátumok vizeletből való előállítátását egyszerű és könnyen kivitelezhető technológiával ipari méretben is gazdaságosan teszi lehetővé. A találmány alapja az a felismerés, hogy az urokináz 10 mérsékelten savanyú vegyhatású közegben kitűnően adszorbeálódik az oxálsav kétértékű kationokkal képzett, 10~3 -nál kisebb oldhatósági szorzatú sóira, ezek felületén teljes mennyiségben megkötődik, majd leoldással visszanyerhető, oldatából könnyen kicsapható, 15 elkülöníthető és lúgos közegben feloldható. így — a kiindulási vizelet-térfogatra vonatkoztatva — 1000-szeres töménységű urokináz-oldatok állíthatók elő. A találmány tárgya eljárás urokináz-koncentrátumok előállítására emlősök vizeletéből, amely abban áll, 20 hogy a vizelethez oxálsavnak kétértékű kationnal képzett, 10_3 -nál kisebb oldhatósági szorzatú sóját adjuk vagy ilyen sót magában a vizeletben hozunk létre a vizelet oxálsavval való előzetes megsavanyítása után, az oxálsavas só felületére adszorbeálódott urokinázt a só 25 felületéről lúgos közegben leoldjuk, az oldatból kisózással kicsapjuk, elkülönítjük, végül lúgos közegben feloldjuk. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös foganatosítási módja abban áll, hogy az oxalát-só képzését bárium- 30 vagy kalcium-ionokkal végezzük és az így nyert sót vizes szuszpenzió formájában 3—6 g/liter koncentrációban adjuk keverés közben a pH 4.0 =4.6 értékek közé megsavanyított vizelethez. Az oxálsav sója felületére adszorbeálódott urokinázt a vizelettől elkülönítjük, 35 majd a só felületéről lúgos közegben neutrális sóval leoldjuk, oldatából sótelítéssel kicsapjuk, elkülönítjük, végül a kiindulási vizeletmennyiség 1—2 ezredrészének megfelelő térfogatú 8—9 pH-jú desztillált vízben oldjuk. 40 A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös foganatosítási módja abban áll, hogy a vizeletet oxálsavval megsavanyítjuk, majd kalcium-hidroxid vagy báriumhidroxid hozzáadásával a vizeletben állítjuk elő a megfelelő oxalát-sót, az ennek felületére adszorbeálódott 45 urokinázt ülepítjük, a vizelettől elkülönítjük, az oxalátsóról lúgos közegben neutrális sóoldattal leoldjuk, az oldatból sótelítéssel kicsapjuk, elkülönítjük, végül a kiindulási vizeletmennyiségre vonatkoztatott 1—2 ezredrész térfogatú 8—9 pH-jú desztillált vízben feloldjuk. 50 A találmány szerinti eljárás értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a vizeletet 10 °C-nál alacsonyabb hőmérsékletre hűtjük, pH-ját jégecettel 4.0—4.6 közé állítjuk, majd literenként 3—6 g kalcium- vagy báriumoxalátot keverünk hozzá vizes szuszpenzió formájában 55 és az adszorbenst 20—30 percig kevertetjük a vizelettel. Célszerűen eljárhatunk azonban úgy is, hogy a vizeletet oxálsavval savanyítjuk meg pH 4.0—4.6 közti értékre, majd kalcium-hidroxid vagy bárium-hidroxid hozzáadásával keverés közben hozzuk létre benne a [60 kalcium- vagy bárium-oxalát adszorbenst, az oxalátsó felületére adszorbeálódott urokinázt ülepítjük, elkülönítjük, a vizelet-alkatrészeket mosással eltávolítjuk. Bármelyik úton nyerjük is az urokináz-adszorbátumot, az urokináz adszorbensről való visszanyerését 0,5- 65 nél nagyobb ionerősségű 7,2—8,2 pH-ra lúgosított sóoldattal 0—25 °C hőmérsékleten két lépésben végezzük úgy, hogy az oldószer térfogata összesen 1/100—1/50 része a kiindulási vizelet-térfogatnak. Az adszorbenstől centrifugálással elkülönített eluátumot célszerűen konyhasóval telítjük, a telített oldat pH-ját 1,5—2,5 közé állítjuk be és a kicsapódott fehérjéket alacsony hőmérsékleten centrifugáljuk. Az urokinázt tartalmazó csapadékot az indulási vizelettérfogatra vonatkoztatott 1/1000— az 1/500-ad rész 8—9 pH-jú desztillált vízben oldjuk és az oldatlan maradékot centrifugálással különítjük el. A találmány szerinti eljárásnak az ismert urokinázkinyerési eljárásokkal szemben fő előnye, hogy kevesebb lépésben igen egyszerű és ipari méretekben is könnyen és gyorsan kivitelezhető módon teszi lehetővé urokinázkoncentrátumok gazdaságos előállítását emlősök vizeletéből. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa 50 liter emberi vizelethez, amelyet 8 °C-ra hűtöttünk, állandó keverés közben vékony sugárban 300 ml jégecetet csurgatunk, ezáltal pH-ját 4,2-re állítjuk be. A keverést tovább folytatva 200 g báriumoxalátot adunk a vizelethez vizes szuszpenzió formájában és ezután még 30 percig kevertetünk. A keverés befejeztével az adszorbenst ülepedni hagyjuk (az ülepedés gyorsan, 2—3 óra alatt teljessé válik), a felülúszót leszívatjuk, az urokináztartalmú csapadékot centrifugáljuk, majd 0,05—0,1 mól/liter konyhasót tartalmazó 4,0—4,5 pH-jú 0,01 mólos acetátpufferrel mossuk 4 lépésben. A mosáshoz 4 X 2,5 liter oldószert használunk és az adszorbenst az egyes mosások között centrifugálással különítjük el. A vizelet-alkatrészek kimosását követőleg az urokinázt 7,8—8,0 pH-jú 0,16 mól/liter trinátriumcitrátot és 0,01 mól/liter kalciumkloridot tartalmazó oldószerrel 0 °C és 5 °C közti hőmérsékleten két lépésben oldjuk le az adszorbensről, összesen 800—1000 ml oldószert használva. Az egyesített eluátumhoz ezután 100 ml-enként 30 g konyhasót adunk keverés közben, s ennek feloldódását követően a pH-t 5-mólos sósavval 1,5—2,5 közé állítjuk be lassú keverés közben. A keletkező urokináz-csapadékot 5 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten centrifugáljuk, s a fölöttes oldat elöntése után az urokinázt a csapadékból 50 ml 8—9 pH-jú desztilláltvízzel oldjuk ki, az oldatlan maradékot centrifugálással különítjük el és eldobjuk. Az így nyert urokináz-koncentrátum térfogata 60 ml, aktivitása Astrup és Müllertz fibrin-lemez módszerével (Arch. Biochem. Biophys. 40, 346, 1952.) meghatározva: 4000 E/ml, összesen 0,24 millió UR-egység, ami a kiindulási vizelet-aktivitásra (5000 E/liter X 50 = = 0,25 millió E) vonatkoztatva 96%-os kitermelésnek felel meg. 2. példa 50 liter vizelethez, amelyet előzetesen 24 órán át 4 °C hőmérsékletű hűtőtérben tartottunk, keverés közben 280 ml jégecetet adunk, így pH-ját 4,5-re állítjuk be, majd vizes szuszpenzió alakjában 300 g kalcium-oxalätot keverünk hozzá. Fél óra elteltével a keverést leállítjuk, a kalcium-oxalátot ülepedni hagyjuk (ehhez 2—3 óra általában elegendő). A vizelet leszívatása után az üledé-2
