163273. lajstromszámú szabadalom • Eljárás urokináz-koncentrátumok előállítására emlősök vizeletéből
163273 ket centrifugáljuk, majd az 1. példában megadott módon mossuk. Kimosás után az urokinázt 7,5—8,0 pH-jú, 0,2 mól/liter trinátrium-citrátot és 0,02 mól/liter kalciumkloridot tartalmazó oldószerrel 4 °C-on két lépésben oldjuk le az adszorbensről, összesen 1000 ml oldószert 5 használva. Az adszorbenst az eluátumtól centrifugálással különítjük el, a két eluátumot egyesítjük, majd mintát veszünk ki belőle és Astrup-Müllertz fibrinlemez módszerével megmérjük aktivitását: 200 E/ml, összesen 0,2 millió E, ami a kiindulási értékre vonatkoztatva 10 80%-os hozamnak felel meg. Az eluátumból az urokinázt 2 °C hőmérsékleten ammóniumszulfáttal való 0,7-es telítéssel csapjuk ki úgy, hogy az eluátumhoz literenként 472 g kristályos ammóniumszulfátot adunk keverés közben, majd ennek oldódása után a reakcióelegy pH-ját 15 2,0-re állítjuk be. A kicsapódott urokinázt 2 °C-on centtrifugáljuk, a fölöttes oldatot elöntjük, a csapadékot 8—9 pH-jú desztillált víz 50 ml-ében oldjuk, az oldatlan maradékot elkülönítjük és eldobjuk. Az így kapott urokináz-koncentrátum összaktivitása 0,2 millió E, ami a 20 kiindulási vizelet-aktivitásra vonatkoztatva 80%-os hozamnak felel meg. mázó 0,0005 mólos oxálsav-oldattal mossuk ki a vizeletalkatrészektől. Az urokinázt az adszorbensről 2 lépésben oldjuk le: először 1 liter, ammóniumhidroxiddal pH 8—9 közé lúgosított 1 mólos konyhasóoldattal, ezt követően pedig újabb 1 liter, 0,05 mól nátríum-citrátot tartalmazó 1 mólos konyhasó oldattal kevertetjük az adszorbenst 4 c C-on 30 percig. Az eluátumokat egyesítjük, majd literenként 250 g szilárd konyhasót adagolunk hozzá kis részletekben, állandó keverés közben. Az oldatot 2 °C-ra hűtjük, pH-ját 5 mólos sósavval 1,7-re állítjuk be és a kicsapódott urokinázt 0 °C-on centrifugáljuk. A fölöttes lé elöntése után a csapadékból 100 ml pH-jú desztillált vízzel oldjuk ki az urokinázt. Az oldatlan maradékot 2—5 °C-on való centrifugálással különítjük el. Az így nyert urokináz-koncentrátum összaktivitása fibrinlemez módszerrel mérve 0,45 millió E, ami a kiindulási aktivitásra vonatkoztatva 90 %-os kitermelésnek felel meg. Lefagyasztott állapotban a koncentrátum aktivitása hónapokon át változatlan marad. Szabadalmi igénypontok 3. példa 50 liter 5 °C-ra lehűtött vizelethez keverés közben azonos hőmérsékletű 0,25 mólos oxálsavat adunk vékony sugárban és pH-ját 3,50-re állítjuk be. A keverést tovább folytatva 0,25 mólos báriumhidroxidot adagolunk mindaddig, amíg a pH 4,5—4,6-ranemáll be. A vizelet kationjaival és a hozzáadott bárium-ionokkal képzett oxalátsókat félórás kevertetés után ülepedni hagyjuk, ezután a vizeletet leszívatjuk és az üledéket centrifugálással összegyűjtjük, majd az 1. példában megadott módon mossuk a vizelet-alkatrészek eltávolítása céljából. Az urokináznak az oxalát-só adszorbensről való leoldását a 2. példában megadott oldószerrel és körülmények között végezzük. Az egyesített urokináz eluátumhoz 100 ml-enként — kevertetés közben — 30 g konyhasót mérünk, majd ennek feloldódása után a pH-t 1,8-ra állítjuk be. A képződött urokináztartalmú csapadékot hűtött körülmények között centrifugáljuk, a fölöttes levet elöntjük, végül a csapadékból 50 ml 8—9-es pH-jú desztillált vízzel oldjuk ki az urokinázt. Az oldatlan maradék elkülönítése után nyert urokináz-koncentrátum összaktivitása fibrinlemez módszerrel meghatározva 0,225 millió E., ami a kiindulási vizelet-aktivitásra vonatkoztatva 90%os nyeredéknek felel meg. 4. példa 100 liter női vizelethez, amelyet előzetesen 2 °C-ra hűtöttünk le, ugyanilyen hőmérsékletű telített oxálsavoldatot adunk keverés közben és pH-ját 3,0-ra állítjuk be. Az erősen megzavarosodott reakcióelegyhez ezután folyamatos keverés közben 0,2 mólos báriumhidroxidoldatot adunk és a pH-t 4,5-re állítjuk be. A képződött oxalátsókat hidegszobában ülepítjük, a fölöttes levet leszívatjuk és az urokináz-tartalmú üledéket az 1. példában megadott eljárással 0,05 mól/liter konyhasót tartal-1. Eljárás urokináz-koncentrátumok előállítására em-25 lősök vizeletéből, amelyre jellemző, hogy a vizelethez oxálsavnak kétértékű kationnal képzett, 10~3 -nál kisebb oldhatósági szorzatú sóját adjuk vagy ilyen sót magában a vizeletben hozunk létre a vizelet oxálsavval való előzetes megsavanyítása után, az oxálsavas só felületére ad-30 szerbeálódott urokinázt a só felületéről lúgos közegben leoldjuk, az oldatból az urokinázt kisózással kicsapjuk, elkülönítjük, végül lúgos közegben feloldjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítás! mód-35 ja, amelyre jellemző, hogy az oxalát-só képzését savanyú vegyhatású közegben, előnyösen pH 4,0—4,6 értékek között 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékleten báriumvagy kalcium-ionokkal végezzük oly módon, hogy a képződött só koncentrációja 3—6 g/liter vizelet legyen. 40 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, amelyre jellemző, hogy a 10~3 -nál kisebb oldhatósági szorzatú oxalátsóra adszorbeált urokináz leoldását 0,5-nél nagyobb ionerősségű, 7,2—8,2 pHa-ra 45 lúgosított sóoldattal 0—25 °C hőmérsékleten végezzük, és sóként konyhasót, nátriumcitrátot vagy ammóniumszulfátot használunk. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, amelyre jellemző, hogy a 10~3 -nál 50 kisebb oldhatósági szorzatú oxalátsón megkötött, majd neutrális sóval leoldott urokinázt oldatából — 5°C és + 5 °C közti hőmérsékleten sóval való telítéssel, előnyösen konyhasóval való kisózással pH 1,5—2,5 értékek között csapjuk ki. 55 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, amelyre jellemző, hogy a 10_3 -nál kisebb oldhatósági szorzatú oxalátsón megkötött, majd neutrális sóval leoldott, oldatából kisózott urokinázt a kiindulási vizelet-térfogatra vonatkoztatott 1/1000-ed— 60 1/500-ad rész 8—9 pH-jú desztillált vízben oldjuk. A kiadáséit felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 74.3301.66-42 — Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató 3
