163131. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bárányhimlő elleni vakcína előállítására

163131 írta a sejtmentes vírus izolálását humán embrió kötőszöveti sejtekből. A hólyagfolyadék természetesen nem megfelelő forrás a vakcina előállítására virulenciája és korlátozott mennyisége miatt. Az emberi pajzsmirigyszövet emellett az elsődleges humán sejtanyaghoz tartozik és így nem megfelelő szövettenyésztési rendszert képez vírusok szaporítása és gyengítése céljaira, élő vírust tartalmazó vakcina előállítására. A sejtmentes vírus izolálása humán embrió kötőszöveti sejtekből Brunell szerint a sejtszuszpenzió ultrahangos kezelését igényli, emiatt ez a módszer ipari méretű vakcinatermelés szempontjából nem használható. Végeredményben a technika állását ismertető szakirodalmi publikációban javasolt eljárások sejtmentes bárányhimlővírus kinyerése szempontjából tömeggyártásra nem alkalmasak. Meglepő módon azt találtuk, hogy a sejtmentes tenyésztési szakasz megvalósítható megfelelő szövettenyészet -készítményen, extra-celluláris (sejten kívüli) élő bárányhimlővírus nagyobb mennyiségben előállítható, és ebből élő bárányhimlővírust tartalmazó Vakcina készíthető. A találmány szerinti eljárás azzal jellemezhető, hogy virulens bárányhimlővírust egy szövettenyészet-rendszeren passzázsokban tenyésztünk. A szövetteinyészet-rendszer a vakcina termelésére tetszés szerinti lehet, amely a vírus szaporodását elősegíti. Ilyen tenyészetet képviselnek a humán diploid-sejttörzsek és a majom eredetű elsődleges sejtek. Az előnyös tenyészetrendszer a majom tesztikuláris szövet és a diploid humán magzati tüdőszövet (Wl-38), amely ismert módokon állítható elő. A Wl-38 ismert szövettenyészet-rendszer, amelyet a Wistar Institute (Philadelphia, Pennsylvania, USA) fejlesztett ki. A szövettenyészet készítési módja és vakcina előállításánál Való alkalmazása a következő szakirodalmi közleményekben van ismertetve: Proceedings of the International Conference on Rubella Immunization és Symposia Series in Immunobiological Standardization, Vol. 11. A tenyészetet 30—34 °C, előnyösen 32 °C-on 10—20 napig inkubáljuk. Az inkubáció tényleges ideje változhat és ezt meghatározza a 2—3 napos időközökben összegyűjtött sejttenyészet mennyisége, amikor a következő passzázsban használt oltóanyagként begyűjtött sejttenyészet maximális fertőzőképességű részét használjuk. Az oltóanyag lehet fertőzött sejtszuszpenzió, gyűjtött tenyészfolyadék vagy gyűjtött szűrt tenyészfolyadék. 5—20 passzázs után az utolsó passzázsból öszszegyűjtött tenyészetet egyesítjük, megfelelő stabilizáló szerrel, mint szacharózzal, albuminnal, glutaminfoszfáttal vagy hasonló stabilizáló szerekkel kezeljük, steril szűrőn szűrjük és egyetlen dózist tartalmazó tartályokba a vakcina forgalomba hozatala céljából bet öltjük. A dózis kb. 0,1—2,0 ml, hatóértéke 100—1000 TCID50

. Lánggal leforrasztott ampullákba helyezzük, vagy pe-25 dig fagyasztva szárított termék alakjában ledugaszolt ampullákban kerül felhasználásra, amelyek steril vízzel oldatba vihetők. A vakcina beadása történhet felszínes bemetszéssel (sokszo-5 ros szúrás), intrakutan vagy szubkután úton. A fenti eljárásban használt oltóvírust bárányhimlő-megbetegedésben szenvedő klinikai beteg hólyagfolyadékából izoláljuk és borjúhúsleves táptalajon —70 °C-on tároljuk. 10 1. példa Élő bárányhimlővírust tartalmazó vakcina előállítása Wl-38 táptalajon húszas passzázsokban. 15 Az alábbiakban ismertetett technológiával a bárányhimlővírust Wl-38 szövettenyészeten 19 passzázsban szaporítjuk. A 19. passzázs 17. és 20. napján begyűjtött tenyészetet egyesítve az élő bárányhimlővírust tartalmazó vakcinát az alábbi módon készítjük. Wl-38 sejttenyészetet készítünk 1850 ml-es palackokban EBME felhasználásával (ez a termék az Eagle-féle közeg kereskedelmi forgalomban levő készítménye Earle típusú lúgos sóoldatban; Az Eagle^közeg összetételét a „Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Infections", 4th Edition, 1969, p. 95 és 96. oldalon ismertetik), amely 10% nem hőkezelt, magzati borjúszéru-3Q mot tartalmaz szaporító közegként. 4 napos utótenyésztés után a szaporító közeget elöntjük, és a palaoktenyészeteket 15 ml 1 : 2 hígítású oldattal palackonként beoltjuk. Az oltóanyag 2 óra leforgása alatt 32 °C-on adszorbeálódik, ezt kö-35 vetően 60 ml 2% inaktivált gamma-borjúszérumot tartalmazó EBME^készítményt a palackba betoltunk. Az inkubálást 32 °C-on görgetett berendezésben végezzük. Négynapos tenyésztést követően a palaoktenyészeteket 100—100 ml 40 Hanks BSS készítménnyel négyszer mossuk. 10% stabilizátort (szacharóz, albumin, glutamin és foszfát) tartalmazó 70 ml 199-es közeget adunk minden egyes palackhoz, és az inkubálást 32 °C-on folytatjuk. 50 mcg/ml koncentrációban 45 neomicint viszünk be a közegbe mosó- és fenntartó közegként. 2—3 napos időközökben a tenyészetet összegyűjtjük és a tenyészeteket stabilizátortartalmú friss fenntartó közeggel ismételten feltöltjük. A fertőzőképességi titráláso-50 kat minden egyes begyűjtött tenyészetnél primer humán magzatburok sejtszövettenyészeten végezzük. A fertőzőképességi titrálásokat 10 alapú logaritmus szerinti hígítási lépcsőben végezzük. A tenyésztő közeg dekantálása után az oltóanyagot adszorbeáltatjuk állandó 32 °C hőmérsékleten sejtlemezeken. Az oltóanyag kémcsövenként 0,1 ml és egy-egy hígítási lépcsőben 4—10 kémcsövet használunk. Az adszorpció lezajlása után 60 2 ml fenntartó közeget adagolunk egy-egy kémcsőbe, és a tenyészetet 32 °C-on inkubáljuk. A mikroszkópos leolvasásokat beoltás után 7 nappal végezzük. A titrálási végpont citopatológiai változásokon alapul. Ez a változás állhat a ke-65 rek alakú sejtek kisebb fürtösödéséből (ezek 55