163090. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztintartalmú peptidek és származékaik előállítására ciszteintartalmú aminosav-szekvenciákból
163090 BOC = terc-butiloxikarbonil. IBu = terc-butil, Acm = acetilaminometil, Bom •= benzoilaminometil, Trt = tritil, Me = metil. 1. példa BOC-Cys-Asn-OtBu állítunk elő, amelyek csak egy diszulfid-hidat tartalmaznak, majd ezeket a szekvenciákat kötjük össze egymással. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szem- 5 léltetik. A példákban a hőmérsékleti adatok Celsius-fokokban értendők. A példákban az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk: 10 15 20 25 30 35 40 45 50 BOC-€ys-Asn-OtBu 463 mg BOC-Cys(Acm)-Asn-OtBu 5 ml metanollal készített oldatát hozzáadjuk 500 mg jód 5 ml metanollal készített oldatálhoz és az elegyet 20° hőmérsékleten 1 óra hosszat állni hagyjuk. Ezután a jód feleslegét 0° hőmérsékleten, vizes n nátriumtioszulfátoldat cseppenként történő hozzáadása útján eltávolítjuk és a terméket víz hozzáadása útján kicsapjuk. Az elkülönített és megszárított csapadékot metanolból átkristályosítjúk. 194—196°-on olvadó kristályokat kapunk. A fenti eljárás BOC-Cys(Acm)-Asn-OtBu kiindulóanyagát az alábbi módon állítjuk elő: 585 mg BOC-Cys(Acm)-OH és 377 mg H-Asn-OtBu 10 ml etilacetát és 5 ml dimetilformamid eiegyével készített oldatához 0° hőmérsékleten 452 mg dicikldhexil-karbodiimidet adunk és az elegyet ugyancsak 0° hőmérsékleten 24 óra hosszat reagálni hagyjuk. Ezután a reakcióelegyet leszűrjük, a szűrletet bepároljuk szárazra, a maradékot etilacetátban oldjuk és n citromsavoldattal, majd n nátriumhidrogénkarbonátoldattal, végül vízzel mossuk. A szerves oldószeres fázist vízmentes nátriumszulfáttal szárítjuk és bepároljuk. A maradékot etilacetátból és n^hexánból kristályosítjuk; az így kapott BOC-Cys(Acm)-Asn-OtBu 97—lj00Q -on olvad. 2. példa: a) BOC-Cys-Asn-OH I Trt-eys-Gly-Glu(OtBu)2 3,2 g jód és 1,38 g piridin (vagy 10 ml 1 mólos ammóniumacetát puffer, pH = 5) 75 ml metanollal készített oldatához keverés közben hozzáadunk 1,18 g BOC-Cys-4Aem)-Asn-OtBu és 1,83 g Trt^Cys(Acm)-Gly-Glu(OtBu)2 peptideket 30 ml metanolban. Az elegyet 2 óra hosszat 20° hőmérsékleten tartjuk, majd a jód feleslegét n nátriumtioszulfát-oldattal eltávolítjuk, az elegyet kb. 20 ml térfogatra bepároljuk és 200 ml jeges vízbe öntjük. Az elegyet leszűrjük és a teriméket vízmentes nátriumhidroxid felett szárítjuk. Ebből a termékből az aszimmetrikus cisztinszármazékot ellenáramú megosztással különítjük el, kloroform-széntetraklorid-metanol-0,1 n ammóniumacetát (1:8:5:1) rendszerben. 500 megosztási lépés után a termék az 50—75. elemben található (K = kb. 0,15). b) BOC-€ys-Asn-OtBu I H-Cys-Gly-Glu(OtBu)-2 1,0)5 g BOC-Cys-Asn-OH Trt-Cys-Gly-Glu(Ot-Bu)2 8 ml jégecettel készített oldatához 2 ml vizet adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten 1 óra hosszat állni hagyjuk, majd a 6 ml vizet adunk hozzá, a kivált tritilkarbinolt kiszűrjük és a szűrletet 30° hőmérsékleten, 0,01 mim Hgoszlop nyomáson bepároljuk. A maradékot etilacetátban oldjuk és az oldatot 0° hőmérsékleten 0,5 n nátriumlhidrogénkarbonát-oldattal, majd vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfáttal szárítjuk és bepároljuk. R/ = 0,50 kloroform-metanol (8 :2) rendszerben. c) BOC-Cys-Asn-OtBu I BOC-Leu-Val-Cys-Gly-Glu<OtBu)2 3,24 g H-Cys-Gly-Glu(OtBu)2 BOC-Cys-Asn-OtBu és 1,34 g BOC-Leu-Val-OH 50 ml dimetilformamiddal készített elegyéhez 0° hőmérsékleten 920 mg N-hidroxi-szukcinimidet és 1,24 g diciklohexil-karbodiimidet adunk. Az elegyet 0° hőmérsékleten 15 óra hosszat reagálni hagyjuk, majd leszűrjük és a szűrletet bepároljuk. A maradékból etilacetát és hexán elegyéből történő kiesapás útján tiszta állapotban kapjuk a fenti vegyületet. R/ = 0,37 toluol-« ceton (1 : 1) rendszerben. R/ = 0,46 kloroform-metanol (9:1) rendszerben. [a]20 D = —67° (c=l,8, metanolban). A fenti eljárás kiindulóanyagait az alábbi módon állítjuk elő: 55 1. Trt-Cys(Acm)-OH 2,3 g H-Cys(Acm)-OH és 2,8 ml trietilamin 50 ml dimetilf ormamiddal készített oldatához 4,2 g tritilkloridot adunk 20 ml dimetilf orm-60 amiddal készített oldat alakjában, majd az elegyet szobahőmérsékleten 24 óra hosszat keverjük. A reákcióelegyet beparolj.uk kb. 10 ml térfogatra, 100 ml etilacetátot és 50 ml vizet adunk hozzá és n citromsav-oldattal 3 pH-értékre állít-65 juk. Az etilacetátüs fázist elkülönítjük, vízzel 3
