163083. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleozid-diofoszfátészterek előállítására
5 fiziológiai sejtfolyamatokban, például a foszfatidok, a seijtfalszenkezet és hasonlók bioszinitézisben. A foszfatidök — így a lecitin, .kefalin, szfingomielin — bioszintézise bázisokból, a bázis 5 aktiválásával megy végbe, a többi, kevésbé bázásDS csoportot tartalmazó vegyületeknél — például szerinnél, inozitnál, fcardiolipinnél — a digldceridek aktiválásával. Az aktiválás minden esetben a megfelelő citidinfoszfát-vegyület kép- 10 ződéséből áll, amely azután az aktív maradékot tovább ítudja közvetíteni. A foszfatid-állománnyal kapcsolatos betegségek egész soránál a foszfolipidek csökkent mértékben keletkeznek, például a „glikolipidbetegségek"-nél, a szfingo- 15 mielináznál (Morbus Niemann—Bieck) stb. A találmány szerinte eljárással előállítoitt citidinfoszfátkoliní például eredményesen adtuk be leeitinvivőként agyvelősérüléses betegnek és ez a klinikai tünetek figyelemreméltó javulását 20 eredményezte. A találmány szerinti eljárással előállított anyag alkalmazása révén jelentős mértékben növelhető volt az agyvelő-sérülteknél a túlélési arány. A következő példák kapcsán közelebbről ismertetjük a találmány sze- 25 rinti eljárást. 1. példa: 30 Uridinfoszfát-glükóz (UDP-glükóz) 10 g uridin-5'-monofoszfoirsavat (U-5-MP), (kb. 30 mmól) 7,5 ml morfolin hozzáadása mellett 500 ml tiszta metilalkoholban oldunk és 35 10 g dicüklohexilnkarbodiimid hozzáadása után a reakció elegyet 50 C°-ra melegítjük. Ehhez az oldathoz lassan hozzácsepegtetjük 90 mmól glükóz-1-foszfát morfoMinsójának 500 ml metilalkohollal készült és tömény sósavoldatital 4-es 40 pH-ra beállított oldatát. 12—15 órás reakcióidő után — mialatt a reakcióelegyet 50 C°-on itartjuk —• erős keverés közben 500 ml izopropanolt adunk a reakcióelegyhez, a kivált csapadékot centrifugáljuk, 250 ml vízben oldjuk, semlege- 45 sítjük, felvisszük egy IMAC—A—17 típusú oszlopra i(50Ö ml térfogat, formiát alak) és eluáljuk 0—0,5 n koncentrációjú lineáris gradiensű ammóniumforniiát-oldattal, melynek pH-értéke 4. Az UDP-glükóz-firakciót, amely kb. 0,4 n 50 koncentrációjú amnióniumformiát-oldattal csepeg le az oszlopról, egy 2 1 térfogatú szénoszlopon átengedve azonnal sótalanítjuk. A szén. ről való eluálást izopropanol : víz : nátronlúg = = 50 : 50 : 0,5 eleggyel végezzük. Az eluátum 55 pH-ját nátronlúggal 7,2nre állítjuk be, az oldatot vákuumban betöményítjük és az UDP-glükóz-nátriumsóját tízszeres térfogatú metilalkohol hozzáadásával kicsapjuk. 60 Kitermelés: 8,5—9,0 g <a kiindulási anyagként alkalmazott U-5'-MP-re vonatkoztatott elméleti értéknek kb. 50%.-a). Hasonló módon kapjuk a galaktóz-1-foszfát morfolinsójából a megfelelő UDP-galaktózt. 65 6 Az UDP-glükóz és UDP-galaktóz extinkciós koefficiense: E2t ;n pH 7,0-nél = 9,9 cm2 //j. mól 2. példa: Adenozindifoszfát-galáktóz (ADP-galaktóz) 15 g galaktóz-1-foszfát-morfolinsót 500 ml metilalkoholban oldunk és az oldat pH-ját tömény sósavoldattal 4-re állítjuk be. Ezt az oldatot lassan hozzácsepegtetjük 5 g adenozin-5'_ -monofoszforsav (A-5'-MP), 3,5 ml morfolin és 5 g diciklohexil^karbodiimid 200 ml metilalkoholial készített 50 C°nra melegített oldatához. 15 órás reakcióidő után, mialatt az elegyet 50 C°-on tartjuk és a pH 4—4,5, erős keverés közben 250 ml izopropanolt adunk a reakció elegyhez. A kivált csapadékot centrifugáljuk, 200 ml desztilált vízben oldjuk, az oldat pH-értékét 7-re állítjuk be és végül felvisszük anioncserélő-oszlopra (500 ml térfogat, Dowex 1X2 típus, formiát alak). A terméket 0,7 n nátriumfoirmiát-oldattal eluáljuk és az 1. példa szeriint szén-oszlopon átfolyatva további feldolgozásnak vetjük alá. Az ADP-galaktóz-nátriumsó kitermelése: 4,5 g (a kiindulási anyagként alkalmazott A-5'-MP-re vonatkoztatott elméleti érték kb. 50%-a). Az ADP-Jgalaktóz exitinkciós koefficiense: E2 6o pH 7,0-nél—15,0 cm 2 /,u,mol 3. példa: Citidindifoszfát-eitanolamin (CDP-atanolamin) 14,5 g etanolamin-foszforsavat (kb. 100 mmól) és 15 g kalciumkloridot {GaClg • 2H2 0) kb. 55 ml desztillált vízben feloldunk, kb. 5 ml koncentrált sósav-oldattal megsavanyítjuk és az oldat térfogatát metilalkoholial 500 ml-re töltjük fel. Ezt az oldatot lassan hozzácseDe<?tetjük 11 g citidin-5'-<monofoszforsav (C-5-MP), 8 ml morfolin és 11 g diciiklohexil-karbodiimid 250 ml metilalkoholial készített 50 C°-ra mélyített oldatához. Kb. 15 órán át tartó reakcióidő után — mialatt az elegyet 50 C°-on tartjuk — 300 ml izopropanolt adunk a reakció elegyhez, a csapadékot leszűrjük, vízben oldjuk, semlegesítjük és anioncserélő-oszlopon (Dowex 1X2 típusú, formiát alak, 50—100 mesh, 1000 ml térfogat) kromatografáljuk. Előmosás után 0,02 mólos hangyasawal eluáljuk a CDP-etanolamint. A CDP-etanolamin-tantalmú frakciókat betöményítjük, nátronlúggal semlegesítjük és végül etilalkohol hozzáadásával kristályosítjuk. A kristályos terméket leszivatjuk, etiL-alkohollal mossuk ós szárítjuk. Kitermelés: kb. 12 g (a kiindulási anyagként alkalmazott C-5'-MP-re vonatkoztatott elméleti érték 70%-a). A CDP-etanolamin extinkciós koefficiense E2 eo pH 7,0-rnél = 7,4 om 2 //anól. 3
