162896. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin B, gentamicin Bl és gentamicin X elnevezésű aminoglikozid antibiotikumok előállítására
162896 9 10 rétegben egy szűrésit elősegítő anyaggal borítottunk be. A szűredék pH értékét 6 n amimóniumhidroxid oldattal körülbelül 7-re beállítjuk, és oxálsavat adunk hozzá, amíg a pH érték 4 lesz. Ilyen mennyiségű oxálaav legtöbbször elegendő ahhoz, hogy a fermentlében levő kalaiumionok oldhatatlan kalciiumoxalátként kiváljanak. A pH értéket 6 n ammóniumhidroxid oldattal körülbelül 7-re állítjuk be, és a keveréket 20—35 C°~on körülbelül 1—4 óra hosszat keverjük. A keveréket megfelelően méretezett és borított szűrőn szűrjük, és a szűredéket felfogjuk. Az antibiotikum keveréket IRC—50 műgyantán (ammóniumifázis) adszorbeáljuk, amikor is az eredeti fermentflé térfogatának 1 literére körülbelül 10 g gyantát számítunk. A gyantát ionmentesített vízzel színtelenre mossuk, az antibiotikumot 2 n ammóniumhidroxid oldattal eluáljuk és az eluátumot vákuumban körülbelül 50% szilárd anyag tartalmú oldattá besűrítjük. B) A gentamicin C komponensek elválasztása a genstamicin A-itól, gentamicin B-től, gentamicin Bi-től és gentamicin X-től 1,3 m3 Dowex 1—X2 gyantáit (Ihidroxilfázis) 91 cm átmérőjű és legalább 244 cm magas kro<matografáló oszlopba töltünk, amely vezetőképességet mérő hídon keresztül frakciógyűjtővel van összekötve. Ionmenitesített vizet szivattyúzunk át a gyantaágyon, amíg a kifolyó víz ellenállása legalább 65 000 ohm lesz. Az oszlopra körülbelül 120 liter 60 kg szilárd anyag tartalmú vizes oldatot viszünk, (készült a A) pont szerint], és az antibiotikum keveréket adszorbeálhatjuk, miközben az 2 liter/perc sebességgel vezetjük át az oszlopon. Az oszlopot körülbelül 2 liter/perc sebességű ionmentesített vízzel kifejlesztjük, és az eluátum vezetőképességéniek megfelelően a frakciókat összegyűjtjük, Általában 7 frakcióit gyűjtünk össze, amelyeknek térfogata 14—750 liter. Az első 5 frakció térfogata körülbelül 500 liter, és a gentamicin, C komponensek fő tömegét tartalmazza. A visszamaradó 2 frakció körülbelül 1500—1600 liter térfogatú, és a gentamicin A, genitaimicin B, gentamicin Bi és gentamicin X fő tömegét tartalmazza. Ez utóbbi frakciókat egyesítjük, vákuumban kis térfogatúra besűrítjük, és liofilizáljuk vagy porlasztással megszárítjuk. Azokban az esetekben, ha a gentamicin C mellett termelt antibiotikumok keverékét használjuk, megfelelő a liofilizált vagy porlasztással szárított anyag. C) Gentamicin A elkülönítése 19,8 kg fermentációs terméket, amelyből a gentamicin C nagy részét eltávolítottuk [készült a B) pont szerint], feloldunk 45 liter forró metanolban. Az oldatot szűréssel derítjük, szobahőmérsékletre lehűtjük, miközben levegővel érinitkeztetjük, és gentamicin A-val beoltjuk. A gentamicin A színtelen karbonát alakjában kikristályosodik, amelyet szűrőn elválasztunk, és kevés metanollal mosunk, 80 C°-on vákuumban szárítunk. 1119 g gentamicin A-t kapunk. Az anyaliúgot és a mosófolyadékokat egyesítjük, vákuumban beparolj.uk , és a maradékot a D) pontban leírt módon kromatograíáljük. 10 D) Gentamicin B, gentamicin B^ és gentamicin X kromatograf álással való szétválasztása Két, egymással sorba kötött, 152 cmXlO cm nagyságú kromatografáló oszlopot feltöltünk 15 kovasavgéllel, amelyet előzőleg kloroform, metanol és tömény ammóniumhidroxid. 1:1:1 arányú keverékének alsó fázisával kezelünk. 750 g C) pont szerint kapott maradékot lehetőleg kis térfogatiban, körülbelül a fenti oldó-20 szerelegy alsó fázisának 2 literében feloldunk. Az antibiotikum oldatot az első oszlopra felvisszük, és az oszlopot körülbelül 3—4,5 liter /óra sebességgel eluáljuk, miközben 2—2 literes frakciókat gyűjtünk össze. A kiáramló folya-25 dékot kovasavgél lemezeken vékonyrétegkromatograf álással ellenőrizzük, amelyhez azonos oldószerrendszert használunk, mint az oszlopon. Az azonos antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és bepároljuk. Ha a gentamicin B 30 mennyisége, amelyet eluálunk, csökken vagy eltűnik, akkor az oszlopot azonos térfogatú metanol és tömény ammóniumhidroxid oldat keverékével eluáljuk az oszlop tökéletes eluálása céljából. A gentamicin B-t és gentamicin B^-et 35 tartalmazó frakciókat etanolban feloldjuk, és az oldatot bepároljuk. Az előző lépések ismétlésével a gentamicin B és gentamicin Bi etanol-szolvátjának kristályos szuszpenziój álhoz jutunk. Ha az előbbiekben leírt kromatografálás-40 sal való elválasztást végrehajtjuk, az alábbi sorrendben a következő mennyiségű termékeket kapjuk: gentamicin C 1 45 gentamicin Bi / gentamicin Bx gentamicin Bi \ 50 gentamicin X / gentamicin X gentamicin X 1 55 gentamicin B / gentamicin B gentamicin 60 gemtamici] in B 1 in A / 198,6 g 42,0 g {a ] 2 V=157° 67.8 g 12,3 g [apó — 153,8° 74.9 g 85,8 g [a]26 D = 132° 165,0 g Az egyes frakciók kitermelléséniek növelése érdekében az antibiotikum keveréket tartal-65 mázó frakciókat újból kromatografállhatjuk. 3
