162896. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin B, gentamicin Bl és gentamicin X elnevezésű aminoglikozid antibiotikumok előállítására

,7 mázó keveréket példáiul Mikromonospora purpurea és Mikromonaspora echinospora tenyésztésével állíthatunk elő, mint azt a 3 091572 számú amerikai szabadalmi leírás ismerteti. A kapott keveréket előnyösen oszlopkro'matográfia alkalmazásával szétválasztjuk, almikor is eluálószerként egy metanolból, kloroformból és ammóniumhidroxidból álló oldószerrendszer alsó fázisát használjuk. A kromatografálás előtt egyenlő mennyiségű oldószereket összekeverünk, ülepedni hagyjuk, és a rétegeket szétválasztjuk. Először a gentaimicin C, amelyet garamicin-nek nevezünk, és 'mint ismeretes 3 komponensből, nevezetesen Ci, Cia és C2 komponensekből áll, eluálódik, majd ezt követi a gentamicin Bi, gentamicin X, gtentamiein B és végül a gentamicin A. A következőkiben részletesen ismerteit'jük a keverék szétválasztási eljárását. A fermentáció befejezése után az antibiotikumot a fermentléből extraháljuk, amikor is a fermentációs tenyészet teljes antibiotikum tö^ megét egy kationcserélő gyantán adszorbeáljuk, például egy Amberlite-típuson, mint amilyen az IRC—50 jelű. A gyantáit előnyösen ammóniaciklusban alkalmazzuk, és a nyers antibiotikum keveréket híg amimóniumhidroxid oldattal eluáljuk. Az eluatumot aktívszénnel vagy előnyösen anioncserélő gyantával, különösen Amiberlite IRA típusú gyantával töltött oszlopon színtelenítjük. Az IRC—50 gyanta eluátumának elszíntelenítésére előnyösen IRA—401S jelű gyantát használunk hidroxilciklusban. Az eluátum elszántelenátése után ezt vákuumban körülbelül 30—60% szilárd anyag tartalmú oldattá bepároJijuk, és a további feldolgozáshoz készen tartjuk. Ebben az időpontban az oldat a fermentáció során termelt összes antibiotikumot tartalmazza, lényegében olyan arányban, amilyenben keletkezik. A keverék 60—'80%-át a gentamicin C komponensek alkotják, és a maradékot a gentamicin C mellett termelt antibiotikumok képezik. Ezért előnyös a gentamicin C legalább egy részét elválasztani, hogy a gentamicin C mellett termelt antibiotikumot kapjuk. Ehhez jelentős számú műgyanta alkalmas. Ilyen műgyanták például az anioncserélő gyanták, mint az Amiberlite IRA—400, Amberlite IRA—401, Dowex 1—X2 és Dowex 2—X4. Általában kvateraier amin típusú porózus, erősen bázikus műgyanták használata célszerű; a Dowex 1—X2 típusú műgyantát hidroxilfázisban részesítjük előnyben. A gentamicin C komponenseit körülbelül 50 000^150 0O0 ohm ellenállású ionmentesített vízzel szelektíven' deszostibeáltuk a gyantáról. Az 'oszlopot előnyösen sorba lehet kapcsolni, és egy vezetőképességet mérő hídon keresztül automatikus frakciógyűjtővel lehet összekötni, így a kifolyó oldószerben a vezetőképesség éles növekedése kikapcsolja a frakciógyűjtőt. Hasonlóan a vezetőképesség csökkenése (az ellenállás növekedése), amelyet a vezetőképesség éles növekedése követ, indítja meg egy új frakció gyűjtését. Az oszlop működtetésének 8 gondossága jelentős mértékben szabályozza a gentaimicin C mennyiségét, amely a gentamicin C mellett termelt antibiotikumok keverékében marad vissza, és bizonyos mértékben bef olyá-5 solja a következő oszlop hatásosságát, amelyet a többi antibiotikum szétválasztására használunk.. A gentamicin C mellett termelt antibiotikumokat a Dowex 1—X2 oszlopról eluáljuk, miután a gentamicin C komponenseket etóávoM-10 tottuk. A vizes elüátumot vákuumban megfelelő térfogatúra bepároljuk és liofilizáljuk. Ennél a lépésnél előnyös az antibiotikum keveréket forró metanolban leioldani és lehűteni, miközben az oldat levegővel érintkezik. A genta-18 micin A a levegőből széndioxidot adszorbeálva nehezen oldható karbonátot képez, amely a metanolos oldatból kikristályosodik; ettől szűréssel elválasztjuk, majd vákuumban szárítjuk. A szűredéket bepároljuk, és a maradékot metanol-20 -kloroform-amimóniumihidroxid 1:1:1 térfogatarányú oldószerkeverék 3 térfogatrész alsó fázisában feloldjuk. A kapott oldatot előnyösen kovasavgélből készült, megfelelően méretezett oszlopra visszük, és az oszlqpot a fenti oldó-25 szereleggyel eluáljuk, miközben az átfolyó mennyiséget ellenőrizzük. A gentamicin B-t és a gentamicin Bi-et kristályos alakban kapjuk; a megfelelő frakciók maradékát etanolban oldjuk, az oldatot vákuumban bepároljuk, a ma-30 radékot újból etanolban oldjuk, és az oldatot ismét egy kristályos szuszpenzióvá bepároljuk. Ez az eljárás lényegében tiszta gentamiein B-t és gentamicin Bi-et szolgáltat etanol-szolvát alakban, amely antibiotikum molekulánként egy 35 molekula etanolt tartalmaz. A gentamicin X-et általában amorf termékként kapjuk, és ez ebben a vonatkozásban úgy viselkedik, mint a gentamicin C komponensek. 40 Egy másik lehetőség szerint az IRA—401S oszlop gentamioin C komponenseket is tartalmazó össz-antibiotikum keverékét kovasasavgélen kromatograf áljuk. Az így elért elválasztás azonban nem olyan éles, mint az az elválasz-45 tás, amelynél a kovasavgélen való kromatografálás előtt a gentamicin C és a gentamicin A nagy részét elválasztottuk. A gentaimicin C komponensek eltávolítása után a gentamicin A-t, gentamicin B-t, gentamicin Bi-et és gentamicin 50 X-et liofilizálhatjúk és baktérium-, féreg- és protozoaellenes hatás elérésére keverékként használhatjuk. 1. példa: 55 A) A gentamicin C és a gentamicin C mellett termelt antibiotikumok elválasztása a fermentlétől 60 A3 091 572 számú USA-beli szabadalmi leírásban szereplő eljárásnak megfelelően készített fermentlé pH értékét 6 n kénsav oldattal 2-re állítjuk be. A keveréket körülbelül 30 percig keverjük, és egy megfelelően méretezett 65 szűrőn szűrjük, amelyet előzőleg 2,5 cm vastag 4