162875. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-tirozin-O-szulfát-csoportot tartalmazó peptidek előállítására
5 162875 6 A 68^100. frakciókat egyesítjük, és liofilizálva 87 mg terméket kapunk, Ultraibolya spektruma: '•max 287 tó//, (f 4230). Aminosav-összetétele (savas hidrolízissei mégállapítva); Asp (2,18), Gly (1,03), Mat (1,72), Tyr (1,02), Phe (1,07). 2: példa: L^Aszparagil-b-szulí áto-L-tirozil-L-metioinil-glicil-L-t!riptoifil-L-meitioinil-L^aszparagil-L-fenilaianin-amid a) NH(tere-Butoxikärbaniil-Ha-benzil-L-j3'-aszparagil-0-l?enzil-L-ti>rozil)-N'benziloxikarboníl^hidrazin 2,7 g N-(terc~bűtoxiikarbonil-0-benzil-L-tirozilJ-N'-benziloxikarbonil-hidrazinból és 25 nil trifluorecetsavból készült 2,5 g (5,8 mmol) N-(0--benzil-L-itirozilJ-N'-benziloxikarboniil-hidrazint feloldunk 20 ml dimetilformamidban, és az oldat pH-ját 0 C°-on ftrietilaminnal beállítjuk 7,5—8 értékre, majd hozzáadunk 2,8 g (6,3 mmól) terc-butoxiikarbaniíl-^ar-benzil-L-^-aszpanaginsav-p-nitrofenilészter. A reakciót szobahőmérsékleten végezzük negatív ninhidrin—reakcióig. Ezután az oldatot 100 ml etilacetáttal hígítjuk,, 20%-os vizes citromsav oldattal mossuk, és nátriuimszulfátön szárítjuk. Vákuumban való bepárlás után a maradékot etilacetátban oldjuk, és a címben megnevezett terméket hexánnal kicsapjuk. Hozam 2,7 g. Olvadáspontja 166— 168 C°. b) terc-Bui toxikarboinil-L-^-aszparagil-;L-(tirozin-hidrazid 2,6 g (3,6 mmól) N-(terc-butoxilkiarboinü-Ja-benzi^L-i^aszparagil-0-benzil-L-ltirozil)-N, -benziloxikarbonil-hidrazinnak 300 ml 2:1:1 arányú metanol-ecetsav-víz eleggyel készült oldatát szobahőmérsékleten atmoszférikus nyomáson 500 mg 10%^-os palládiumszén jelenlétébein 4—5 óra hosszait, a széndioxidfejlődés megszűntéig hidrogénezzük. A katalizátor eltávolítása után az oldatot bepároljuk, és a száraz kristályos maradékot izopropiléterben szuszpendáljuk, a szuszpenziót szűrőre visszük, és a termékeit megszárítjuk. Hozam 1,4 g. Olvadáspontja 193—195 C°. c) terc-Butoxikarbonil-L-imetianiil-glicil-L-triptofil-L^meitiönil-L-aszparagil-L_ -fenilalaniin-amád Anderson és munkatársai [Tetrahedron suppl. 8. sz., 39 (1966)] szerint, készült 154 g (20 mól) gHcil-L-triptofil-L-.mertiioinil-L-,aszpiara;gil-L-fenilianim-amid-trifluoracetátot 9,8 g (23 mmól) terc-butoxikarbonil-L^metionin-2,4,5-triiklór-fenilészterrel acilezümk. A terméket az oldatból etilacetáttal kicsapjuk, és 95%-os etanolból átknistályosítjuk. Hozam 10,2 g (60i%). Olvadáspontja 184—185 C°. d) terc-Butoxikiarbonil-L-.'/jHaszparagil-LHtirozil-L-metioinil-glicil-L-itriptofil-L-metioinil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amid 5 310 mg (0,77 mmól) terc-butöxikarbanil-L-i^-aszparagil-Lntirozin^hidrazidnak 2,3 ml dimetilf ormamidiM készült oldatához mechanikus keverés közben szilárd széndioxid-aeetoh fürdőben ^—20 C-^öm hozzáadunk 0,37 ml tömény sósavait; 10 Három perc múlva hozzáadunk 0,38 ml 14%-os vizes nátriumnitrdt oldatot, miközben a fürdőhőmérsékletet változatlanul tartjuk. A reakciókeveréket még 3 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk, majd hozzáadunk 0,61 ml N-etilpiperi-15 dint, és utána 600 mg terc-butoxiikarbonil-L-metioinil-glicil-L-ttriptofil-L-metionil-L-aszparagil-L-fe-niilanilin-aimidból trifluorecetsavval készült 556 mg (0,61 mmól) 1,5 ml dimatilformamldban oldott L-metionil-glieil-L-triptofil-L-20 -metionil-L^aszparagil-L-fenilalanin-amidot. A reaikciókeveréket 24 óra hosszat 4 C°-on tartjuk, majd egy második adag terc-butoxikiarbonil-L-/?-aszparagil-L-tirozin-hidrazidot adunlk hozzá. Amikor a ninhidrin reakció negatív (további 24 25 óra múlva), a keveréket élénk keverés közben 30 ml 3'%-©s ecetsavba öntjük. A kicsapódott oktapeptidet szűrőre visszük, 3%-os vizes ecetsavval többször mossuk, és vákuumban megszárítjuk. Etanolból átkristályosíitva 350 mg ter-30 méket kapunk. R/-értéke 0,75. Aminosav-Összetétele (savas hidrolízissel megállapítva): Asp (2,1), Tyr (1,0), Gly (1,0), Met (2,0), Phe (0,94). 35 e) L^/?-Aszparagil-0-szulfáto-L-tirozil-L-•imetionil-glicil-LHtriptofil-L-metionil-L^aszparagil-L-fenilalanin-amid r 310 mg (0,3 mmól) terc-butoxikarbonil-L-;^ 40 -aszparagil-L-itirozil-L-metioniil-glicil-L-triptofilh -L-metionil-L-aszparagil-L-fenilalaniin-amid'oit feloldunk 18 ml vízmentes dimetilformamid és 18 ml frissen desztillált piridin elegyében. Ehhez az oldathoz hozzáadjuk 936 mg piridinszul-45 fátnak 18 ml dimetilformamiddal készült oldatát. A kapott oldatot 17 óra hosszat szobahőmérsékleten tartjuk, majd vákuumban bepároljuk. A száraz maradékot több ízben 15 ml vízzel mossulk, és vákuumban megszárítva 395, mg 50 reakcióterméket kapunk. Ezt a nyers vegyületet 20 percig 5 ml triflüofecetsavval reagáltatjuk;. A savat vákuumban;; eltávplítjuik, a kapott trifluoracatátot dietiléterrel digeráljuk, megszárítjuk. A nyers oktapeptidszulfátot 0,1 mólos am-56 móniumkarbonát oldatban oldjuk, és DEAE-Sephadex A—25 oszlopon kromatografálva tisztítjuk. Az 1,5 cm átmérőjű és 15 cm magas oszlopot összesen 350 ml 0,1 mólos és 350 ml 1,5 mólos vizes ammóniurnfcarboinát" oldatból 60 készült lineálisan növekvő koncentrációjú elegyekikel eluáljuk, és 7 íhl-es frakciókat gyűjtünk, és ezeket 253 .m/i-nál észlelhető , ultraibolya elnyelésre vizsgáljuk. A 68—100. frakciókat egyesítjük, és liofilizálva 87 mg termékeit 65 kapunk. Ultraibolya spektruma: %max 288 mi/* 3
