162835. lajstromszámú szabadalom • Vacina csirkék marek-féle megbetegedéssel szembeni immunizálására
162835 lejártával a túlélő állatokat leöltük és felboncoltuk. ('') A vírust a túlélő állatok veséjéből a közvetett csirkevese-tenyésztési módszerrel különítettük el. A tört számlálójában a vírussal megfertőzött túlélő állatok, számát, a nevezőben az összes túlélő állatok számát adtuk meg. A kísérlet az AHIV egy új jellemzőjét igazí-lja, vagyis azt, hogy a' vírus-vakcina a beoltott szárnyasokban nem szűnteti meg az MBHV fejlődését. Annak ellenére, hogy a 20 hetes csirkékből AHIV és MBHV vírusokat egyaránt elkülönítettünk, az MB vírus által okozott megbetegedés egyetlen tünete sem lépett fel. Azokat a csirkéket, amelyeken vizuálisan nem észleltünk betegségi tüneteket, boncolás után mikroszkópos vizsgálatnak vetettük alá. A táblázat ,,MB-reakció" rovatában azoknak az állatoknak a %-os arányát tüntettük fel, amelyeken vizuálisan vagy mikroszkópos vizsgálattal MBHV által előidézett elváltozásokat észleltünk. A találmány szerint előállított vakcina jellemző, és a legyengített MBHV-t tartalmazó vakcináktól eltérő tulajdonsága az, hogy az élő AHIV sejtmentes állapotban is hatásos immunológiai szer (lásd a 7. példát). A sejtmentes vakcinák előnye, hogy könnyen tárolhatók, és .lines szükség a sejttartalmú vakcinák tárolására érvényes különleges előírások és követelmények betartására. A sejtroncsolást különböző módszerekkel, pl. hangbesugárzással vagy fagyasztásos-olvasztásos kezeléssel végezhetjük. Előnyösen a hangbesu^árzást alkalmazzuk, ugyanis ez a kezelés könynyen és gyorsan végrehajtható. Ha a mintát 2(1 másodpercig szónikus készülékkel kezeljük, a vakcinában hemocitométeres vizsgálattal mir nem mutathatók ki ép sejtek vagy sejtmagok. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példában részletesen ismertetjük. 1. példa: Két 23 hetes pulykából veseszövet-mintákat különítünk el (FCI 26), a mintákat foszfátpuffert tartalmazó sóoldattal mossuk, ollóval felaprítjuk, ismét mossuk, és 37 C°-on 0,025%-os tripszinben diszpergáljuk. A kapott sejtszuszpenziőt 24 órás egyrétegű csirkevese-sejttenyészethez [Witter és mtsai: Avian Diseases 13, 101—118 (1969)] adjuk, és 1 napig 37 C°-on inkubáljuk. Ezután a tenyésztési közeget kicseréljük, és a tenyészetet további 15 napig inkubáljuk. Az egyes lemez-tenyészetekhez 25 ml standard csirkevese-tenyésztési közeget használunk fel. A közeg összetétele a következő: 10 15 20 3-1 *'!5 10 45 50 S5 60 8 Bovin magzatszérum 5" o Penicillin 100 egység/ml streptomicin 0,1 mg ml 8% mikosztatin 25 egység ml i1 ) Biochemists' Handbook, D. Van Nostrand Co. Inc., Princeton, New Jersey, 1981, 1084, oldal. Az inkubálás után a teljes sejttömeget foszfátpuffert tartalmazó sóoldattal mossuk, 4 ml 0,05%-os tripszinben diszpergáljuk, a kémcső térfogatának 10%-át kitöltő mennyiségű borjúszérumot tartalmazó kémcsövekbe töltjük, és 1000 g gyorsulással centrifugáljuk. A felső for lyadékréteget eltávolítjuk, és a szilárd anyagot Lsmét kb. 1 ml táptalajba szuszpendáljuk. A szuszpenziót friss 24 órás csirkevese-sejttenyészetre helyezzük, és 5 napig 37 C°-on inkubáljuk. Az FCI 26 vírusizolátumot a fenti módon csirkevese-sejttenyészeten összesen hatoszor tenyésztjük. Az utolsó tenyésztéskor kapott sejteket mossuk, tripszinnel kezeljük, a fenti módon --certrifugáljuk, és 15% borjúszérumot és 10% dimetilszulfoxidot tartalmazó 1 ml tápoldatban diszpergálva tároljuk. A szuszpenziót lassú ütemben a folyékony nitrogén hőmérsékletére (—70 C°) fagyasztjuk, és oltótenyészetként használjuk nagyobb tömegű vakcina előállítására. A végső lépésben kapót szuszpenzió sejtkoncentrációja: 3,8X10Ü sejt/ml. = 5X10 4 FKE/ml. 2. példa: Az 1. példában említett pulykából vérmintákat veszünk le. A vérmintákat heparinnal [20 egység/ml] kezeljük, és közvetlenül felhasználjuk 24 órás egyrétegű kacsaembrió-kötőszövettenyészet beoltására. A tenyésztéssorozatot és az inkubálást az 1. példában leírt módon végezzük; összesen 7 tenyésztési lépést alkalmazunk. A kacsaembrió-kötőszövet tenyésztésére felhasznált közeg összetétele a következő: Közeg (199X10) 40% • Id. a 3. Táptalaj (F1OX10) 50% táblázatot Triptóz-foszfát táptalaj 30 g/l 5% 2,8%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-old. 3% Borjúszérum 4% A hetedik tenyésztési lépés után 2X1 ml-es vakcinamennyiséget állítunk elő, amelyet az 1. példában leírt módon tárolunk. A vakcina végső koncentrációja: 6,9X10« sejt/ml = 1,5 X 105 FKE AHIV/ml. Eagles alap-táptalaj (BME) 1 Triptóz-foszfát táptalaj 30 gA 2,8%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát oldat 80% 10% 3% 3. példa: Kb. 3,3X10'- FKE mennyiségű, a 2. példában 65 előállított AHIV-val 6 db, egyenként 150X25 4
