162835. lajstromszámú szabadalom • Vacina csirkék marek-féle megbetegedéssel szembeni immunizálására
162835 9 mm méretű műanyag tenyésztőedénybe helyezett, egybefüggő 24 órás egyréteges kacsaembrió-kötőszövet-sejttenyészetet fertőzünk meg. Tenyésztési közegként a 2. példában ismertetett közeget használjuk, lemezenként 25 ml közeget alkalmazunk. A megfertőzés utáni napon a közeget kicseréljük, és a tenyészetet további 2 napon át inkubáljuk. Ekkor a kacsaembriókötőszövet sejtjeinek több mint 75%-a megfertőződött, és a sejtek sorozattenyésztésre alkalmassá váltak. A sejtek áthelyezését a következőképpen végezzük: A tenyésztési közeget eltávolítjuk, a sejteket foszfátpuffert tartalmazó oldattal egyszer mossuk, majd a sejtebet 5 percig 4 ml 0,25%-os tripszinoldatban tartjuk. A fellazult sejteket ezután a tripszin hatásának lelassítása céljából kb. 10 térf.% mennyiségű borjúszérumot tartal-10 10 mázó kémcsövekbe helyezzük. A sejteket centrifugálással ülepítjük (centrifugálási gyorsulás: kb. 1000 g, centrifugálás ideje: 5 perc), majd a sejteket a táptalajbán ismét szuszpendáljuk, és* a 6 lemezről elkülönített sejteket 48 db 150X25 mm méretű lemezen oszlatjuk szét. A lemezekre előzőleg 24 órás egyrétegű kacsaembrióJsötőszövet-sejttenyészetet helyeztünk. Az utóbbi művelet után 3 nappal, amikor a sejtek nagy része megfertőződött, a sejteket az előzőekben leírt tripszines kezeléssel elkülönítjük, 10% dimetilszulfoxidot tartalmazó közegben szuszpendáljuk, lassú ütemben fagyaszt-15 juk, és folyékony nitrogén hőmérsékletén tároljuk. Kb. 100 db 1 ml-es ampullás készítményt állítunk elő, amelyek ampullánként IX X107 sejtet, azaz 1X10 6 EKE mennyiségű vírust tartalmaznaik. 20 3. táblázat A 2. példában felhasznált közegek összetétele Komponens 199 g/l P10 Komponens mg/l 199 F10 L-arginim (HCl) 0,070 0,211 L-hisztidin (HCl) 0,20 0,021 L-lizin HCl 0,070 0,029 DL-triptofán (L) 0,020 0,0006 DL-fenilalanin <L) 0,050 0,005 DL-metionin (L) 0,030 0,004 DL-szerin (L) 0 0V) 0 0'i DL-treonm <L) 0,060 0,004 DL-leucin (L) 0,120 0,013 DL-izoleucin (L) 0,040 0,003 DL-valin (L) 0,050 0.004 DL-glutaminsav (L, vízm.) 0,150 0,015 DL-aszparaginsav (L) 0,060 0,013 LD-*GM-danin (L) 0,050 0,009 L-prolin 0,040 0,012 L-hidroxiprolin 0,010 glicin 0,050 0,008 L-glutamin 0,100 0,146 L-cisztin 0,020 L-tirozin 0,040 0,002 L-ásztein HCl (szabad bázis) 0,0001 0,025 L-aszparagin 0,013 NaCl 8,0 7,4 KCl 0,400 0,285 MgSCv7H2 0 0,200 0,153 Na2 HPCv7H 2 0 0,090 0,290 KH2 P0 4 0,060 0,083 CaCl2 (2H 2 0) 0,140 0,044 NaHC03 0,350 1,2 Fe(N03 ) 2 0,0001 Dextróz 1,000 1,100 Piroszőlősav-nátriuimsó 0,110 Fenolvörös 0,020 0,0012 Zsírsav 0,0002 Megjegyzés: A „Komponens" rovatban zárójelbe FeS04 -7H 2 0 CuS04 -5H 2 0 ZnS04 -7H 2 0 Tween 80 ATP Adenilsav Dezoxiribóz D-ribóz nátriumacetát • 3 H2 0 aderain guanin xantin hipoxantin uracil timin tiamin (HCl) pdridoxin-HCl riboflavin piridoxál-HCl niacin rúacinamid Ca-pantotenát (D) i-inozit aszkorbinsav fólsav p-amino-benzoesiav biotin menadién glutton A-vitamin kalciferol koleszterin Bi2 -vitamin timidin kolinklorid Na2-a-tokoferol-foszfát tett adatok az F10 jelzésű 2,0 0,004 0,051 5,0 1,0 0,200 0,500 0,500 0,050 10,0 0,300 0,300 0,300 4,00 0,300 0,300 0,010 1,0 0,025 0,206 0,010 0,376 0,025 0,025 0,025 0,615 0,010 0,715 0,050 0,541 0,050. 0,010 1,0 0,050 0,010 0,024 0,010 0,050 0,100 0,100 0,200 1,0 1,0 0,500 0,698 0,010 "közegre vonatkoznak
