162834. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum kinyerésére és tisztítására

162834 8 Ebből a tenyészetből steril pipettával bemérünk 5 ml-t (oltóanyag: 10%) azonos méretű és az előbbi tápoldatot tartalmazó 4 db második oltólombikba és az előbbi módon rázógépen inkubáljuk. A második oltólombikok tartalmát, steril körülmények között, égy lombikba összeöntjük, és a tenyészetből 2—3% oltóanyaggal beoltjuk a 11 db 2 l-es ledugaszolt Erlenmeyerlombikba mért 350 ml II. tápoldatot. A II. tápoldat a következő anyagokat tartalmazza: II. tápoldat: Sárga élesztő No. 300 10,0 g Desztillálási maradék 20,0 g Dextróz 10,0 g Desztillált víz 1000,0 m pH 7,0 Az antibiotikumot termelő lombikokat ezután 145 fordíperc és 5 cm lökethossz mellett 28 C -on 4 napon át rázatjuk. Az inkubációs idő letelte után 10 lombik trtalmát egyesítjük, majd az oldatból a micéliumot centrifugálással eltávolítjuk. B: Adszorpció anioncserélő gyantán A 2900 ml szűrt fermentlevet hígított sósavval pH 7,0-ra állítjuk be, majd 100 ml kloridfázisú Dowex 1X2 gyantaoszlopon (stirol-divínilbenzol alapú, erősen bázikus anioncserélő gyanta) 10 ml/perc sebességgel áteresztjük. Az elfolyó oldatot 500 ml-es frackióba gyűjtjük. A gyanta-oszlopot vízzel mossuk, majd 3% ammóriiumkloridot tartalmazó 90%-os metanollal eluáljuk. Az eluátumot 100 ml-es frakciókba gyűjtjük. Mindegyik -frakciót Vibrio percolans ATCC 8461 mikroorganizmussal készített korong-vizsgálati módszerrel megvizsgáljuk; a kapott zónaátmérőket az alábbi táblázat tünteti fel: Szűrt fermentlé Elfolyó oldat Eluátum hí- zóna zóna zóna gí- átmérő frakció átmérő frakció átmérqj tás mm mm mm 26,5 1. 0 1. 25 1 :2 24 2. 16 2. 29 1 :4 20 3. 23 3. 29 4. 25 4. 26,5 5. 27 5. 22 6. 27 6. 7. 8—10. 18 15 0 A vizsgálatok jelzik, hogy a gyanta kapacitása csupán két frakció, vagy a fermentlé 10 oszlop-térfogata. C: Adszorpció anioncserélő gyantán Az előbbi B-lépés 3—6. frakcióit egyesítjük és így 1960 ml oldatot kapunk. Az oldat 1860 10 Üö 35 10 15 61 65 ml-ét híg nátriumhidroxid-oldattal 7,2—8,0 pH-ra állítjuk be és 100 ml klorid-fázisú Dowex 1X2 gyantaoszlopon (stirol-divinilbenzol alapú, erősen bázikus anioncserélő gyanta) 14 ml/perc sebességgel áteresztjük. Az elfolyó oldatot négy egyenlő frakcióba felfogjuk, melyet megvizsgálva 5% aktivitást kapunk. Az oszlopot vízzul mossuk és 5%-os vizes nátriumklorid oldattal eluáljuk. Az eluátumot 50 ml-es frakciókba gyűjtjük és vizsgáljuk. A vizsgálatok a 3—16. frakciókban az aktivitás 90%-át mutatják. Ezeket az oldatokat betöményítjük. D: Adszorpció kationcserélő gyantán Az egyesített 3—16. frakciókból 50 ml részt 500 ml-re hígítunk, hígított sósavval 8,8 pH-ról 2.0 pH-ra állítjuk be és 25 ml hidrogénfázisú Dowex 50X2 gyantaoszlopon (szulfonált stirol-divinilbenzol alapú, erősen savas kationcserélő gyanta) 2,5 ml perc sebességgel áteresztjük. Az oszlopot 25 ml vízzel mossuk, 2%-os vizes piridinnel eluáljuk, míg az oszlopról elfolyó oldat pH-ja 7,0 pH-ra nem növekszik (54 ml). A vizsgálatok azt mutatják, hogy az elfolyó oldatban az aktivitás 9%-a míg a piridines eluátumban az aktivitás 90%-a van jelen. Az eluátum a 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-cef-3--ém-4-karbonsav piridin sóját tartalmazza. Az oldatot nátriumhidroxiddal pH 8,0-ra állítjuk bo és vákuumban, a piridin eltávolításával betöményítjük. Az így kapott anyag a 7-(D-5--amino-5-karboxivaleramido)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-cef-3-ém-4-karbonsav mononátrium-sója. Molekulasúlya 468, tapasztalati képlete C|i(

H)|N/,SO:iNa. A termék amfoter

tulajdonságú, izoelektromos pontja kb. 3,5 pH-nál van, 9 pH fölött nem stabil, 1,5 pH-ig azonban stabil. 2. példa: Adszorpció aktív szénen Az 1. példa A) lépése szerint készített négy külön fermentáció fermentlevet az 1. példa B) és C) lépése szerint Dowex gyantán folyatjuk át és a gyantán adszorbaált anyagot 1%-os vizes nátriumklorid oldattal eluáljuk. Az eluátumot 50 ml-es frakciókba egyesítjük és vizsgáljuk. Négy fermentáció eluátum-frakcióját, mely a 7(D-5-amirio-5~karboxivaleramido)-3--(karbamoiloximetil)-7-metoxi-3-cef-3-ém-4-karbonsavat tartalmazza, hígított sósavval pH 5-re állítjuk be és így egyesítve 4300 ml oldatot kapunk. Ebből az oldatból 4200 ml-t 42 g aktív szénnel (Darco G—60) V2 óra hosszat keverünk. Az aktív szenet szűrjük és vízzel mossuk. A szűrletnek és a mosóvíznek aktivitása nincs. A leszűrt aktív szenet V2 óra hosszat tartó keveréssel kétszer 1 1 60% vizes acetonnal eluáljuk és mindegyik esetben szűrjük. Az eluátumokat vákuumban 108 ml-re, illetőleg 100 ml-re betöményítjük. A Vibrio percolans ATCC 8461-ei végzett biológiai vizsgálat azt mutatja, hogy az 4