162834. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum kinyerésére és tisztítására
162834 oldószerrel, pl. 60%-os vizes-acetonnal eluálva eltávolítható. Mint ahogy azt az előbbi tisztítási módszereknél leírtuk, az eluciót úgy végezzük, hogy az így kapott frakciók, biológiai vizsgálattal meghatározva, az antibiotikumot a leg- 5 nagyobb koncentrációban tartalmazzák. Ki kell emelni, hogy a 7~(D-5-amino-5-karboxivaler-amido)~3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-cef-3-ém-4-karbonsav vagy sóinak nyers vizes 10 oldatából való tisztítására és/vagy kinyerésére az itt leírt módszerek közül néhány — vagy akár mindegyik, bármilyen formában — felhasználható az antibiotikum tiszta oldatának előállítására, bár az erősebben szennyezett oldat 15 tisztítására előnyös ioncserélőket alkalmazni. A gélszűrés és az aktív szenes módszer előnyös, ha a kiindulási anyag legalább már részben. tisztítva volt. Az I. képletű antibiotikum^vegyület és sói Nemcsak a penicillinázzal, hanem ezenkívül a cefalosporinázzal szemben is ellenállók és a gram-negatív mikroorganizmusokkal szemben fokozottabb aktivitást mutatnak. A találmány szerinti termékek — a gyengébb antibakteriális aktivitással rendelkező cefalosporin C-vel szemben — erősebb „in vivo" gram-negatív hatást mutatnak, mely általában erősebb mint a cefalotin hatása. Ez az aktivitás magába foglalja a Proteus morganii-ra mutatott „in vivo" hatékonyságot, és ezen túlmenően a következő gram-negatív baktériumokkal szembeni hatékonyságot: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella schottmuelleri, Klebsiella pneumoniae AD, Klebsiella pneumoniae B és Paracolobactrum arizoniae. Az antibiotikum biológiai vizsgálatát korongmódszer (1,27 cm átmérőjű szűrőpapír korongok) alkalmazásával folytatjuk le. A vizsgáló korongokat — lemezenként 10 ml felhasználással — Difco tápágárral és 2,0 g/l Difco élesztő extrattal kezeljük. A teszt-organizmust egy éijelen át szaporítjuk, a Vibrio percolans ATCC 8461-t steril sóoldattal hígítjuk, míg a szuszpenzió 680 m/fj, hullámhossznál 40i% áteresztési nem mutat. Ezt a szuszpenziót 20 ml'l mennységben a tápoldathoz adjuk, mielőtt a lemezre öntjük. A vizsgáló-korongokat a felhasználásig 4 C°-on tartjuk (max. 5 nap). Ezt követően az antibiotikummal telített vizsgáló-korongot az előbbi lemezre helyezzük és 8—24 óra hosszat 28 C°-on inkubáljuk. A gátlási zóna átmérőjét m-ben olvassuk le. A módszert a relatív hatás meghatározására használjuk, ha tisztított standard mintával hasonlítjuk össze, akkor az eredmányt juglml-ben kapjuk. A 7-(D-5-amino-5-karboxrvalera;mino)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-cef-3-ém-4-karbonsavat a Streptomyces lactamdurans NRRL 3302 mikroorganizmussal beoltott, megfelelő vizes tápoldattal — ellenőrzött körülmények között — végzett aerob fermentációjával állítjuk elő. A 65 20 25 30 35 40 45 50 55 60 más antibiotikumok előállítására használt vizes tápoldatok alkalmasak a 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-cef-3-ém-4-karbonsav antibiotikum előállítására is. Ezek a tápoldatok a mikroorganizmusok által asszimilálható szén- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmaznak. A tápoldat asszimilálható szénforrásként általában szénhidrátokat tartalmaz: mint cukrokat, pl glükóz, arabinóz, maltóz, raffinóz, xilóz, mannit és hasonlók; keményítőket, mint amilyen a gabona, pl. zab, rozs, gabonakeményítő, gabonaliszt és hasonlók. Ezek az anyagok önmagukban, vagy egymással keverve is -használhatók. A tápoldatban alkalmazott szénforrás, vagy szénforrások pontos mennyisége, részben a tápoldat más komponenseitől függ. A szénhidrát mennyisége általában a tápoldat súlyára számítva 1—6% között váltakozik. A fermentációhoz nitrogénforrásként általában fehérjéket tartalmazó anyagokat használunk. Ilyen nitrogénforrások pl.: élesztő-hidrblizátum, sárga élesztő, szójababliszt, kazeinhidrolizátum, kukoricalekvár, desztillálási maradék, vagy paradicsompaszta és ' hasonlók. Ezek a nitrogénforrások önmagukban, vagy egymással keverve, a tápoldat súlyára számítva 0,2— 6% közötti mennyiségben is használhatók. A fermentációt 20—37 C° közötti hőmérsékleten folytatjuk le, bár az optimális eredményt a 24—32 C° hőmérséklettartományban végzett fermentáció adja. A Streptomyces lactamdurans kultúra tenyésztésére és az antibiotikum termelésére a tápoldat pH-ját 6,0 és 8,0 pH között kell tartani. A következő példák a találmányt szemléltetik, de nem korlátozzák. 1. példa: A: Fermentáció Liofilizált Streptomyoes lactamdurans NRRL 3802 kultúrával beoltunk 200 ml-es ledugaszolt Erlenmeyer lombikba mért 50 ml sterl I. tápoldatot. I. tápoldat Élesztő autolízis terméke (ardamin) 10,0 g Glükóz 10,0 g + Foszfát-puff er 2,0 ml MgSo4 -7H 2 0 0,05 g Desztillált víz 1000.0 ml pH 6,5 +Foszfát-puff er: Káliumdihidrogénfoszfát 91,0 g Dinátriumhidrogénfoszfát 95,0 g Desztillált víz 1000,0 ml A beoltott lombikot 120 ford; perc és 5 cm lökethossz mellett, 28 C°-on 72 óra hosszat rázógépen inkubáljuk. 3
