162334. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rabelomicin és dehidrorabelomicin antibiotikumok előálítására
162334 kémiai eltolódás jelleq relatív terület 1,47 s 3 2,37 széles 1 2,98 s 2 3,06 s 2 6,92 s 1 7-8 m 3 11,60 s 1 12,21 s 1 s = szinglett m= multiplett Egy kétszeres kémcsöves higitásos próbában kristályos rabelomicinnel a legkisebb gátló koncentráció Mglml-ben a következő volt: mikroorganizmus Mg/ml Staphylococcus aureus 209P 6,3 Streptococcus pyogenes C203 1,2 Bacillus subtilis 4,7 Escherichia coli - 50 Salmonella schottmuelleri ->50 Pseudomonas aeruginosa >25 Candida albicans v 50 Trichophyton mentagrophytes •; 25 A rabelomicin felhasználható a kutatásban és kórházi laboratóriumokban Gram-negatív baktériumok elkülönítésére talajokból, tamponokból vagy testi váladékokból, ha azokban Grampozitív és Gram-negatív baktréiumok vegyesen találhatok. A rabelomicin alkalmas továbbá Staphylococcus aureusszal fertőzött laboratóriumi berendezés fertőtlenítésére, különösen akkor, ha a fertőtlenítés szokásos módja kárára lenne a berendezésnek. A következő példák szemléltetik a találmányt; /. példa Paradicsompép- zabüszt agart beoltunk a bevezetésben leírt módon nyert Streptomyces olivaceus ATCC 21549 törzzsel. A ferde tenyészetet 14 napig inkubáljuk, majd felhasználjuk 250 ml-es Erlenmeyer-lombikokban lévő 50-50 ml vizes szójabablisztes táptalaj beoltására. A táptalaj összetétele a következő: szójababliszt szárított őrölt burgonya glukóz CoCl,.2H2 0 CaCO, agar desztillált vízzel kiegészítve 1000 ml-re. A táptalajt beoltás előtt sterilizáljuk 30 percig 121 C-on 1 att gőznyomáson. A beoltott lombikokat 25 C°-on 72-96 óra hosszat inkubáljuk 5 cm lökettel percenként 280 fordulatú rázógépen. A lombikokból 5 tf#~ot átviszünk 100-100 ml következő összetételű táptalajt tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyerlombikokba: g szójababliszt 30,0 szárított őrölt burgonya 15,0 glukóz 15 0 CoCl2 .2H 2 0 0,005 CaCo3 10,0 desztillált vízzel kiegészítve 1000 ml-re. A fermentációs lombikokat ugyanúgy inkubáljuk rázás közben, mint a szaporítólombikokat. A 72. és 96 órában mintákat veszünk, és azokat centrifugáljuk. A folyadékot leöntjük, és a micéliumot a leöntött folyadékkal azonos térfogatú metanollal extraháljuk. A leöntött folyadékot fél térfogatnyi vízzel telített etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos és a metanolos kivonatokat kovasavgélen kromatografáljuk 94:5:1 térfogatarányú kloroform-metanol-piperidin oldószerrendszerrel. Ebben a rendszerben az antibiotikum Rfértéke mintegy 0,45. Az antibiotikumot bioautografikusan mutatjuk ki Staphylococcus aureus 209P-vel. A 72 és 96 órás fermentáció metanolos és etilacetátos kivonatainak aktivitása rabelomicinből származik, mint azt a kromatográfiai és bioautográfiai próbák mutatják. c 2. példa Streptomyces olivaceus ATCC 21549 250 literes adagját fermentáljuk egy 400 literes rozsdamentes acél tartályban a következő üzemi körülmények között; 1. lépés 10 Oltóanyag: tejben liofilizálva eltartott Streptomyces olivaceus ATCC 21549 tenyészetet paradicsompép-zabliszt agárban szaporítunk. A ferde felszíni telepet szuszpendáljuk 11 ml 0,01%-os nátriumlaurilszulfát oldatban, és ebből a szuszpenzióból 3 ml-et használunk oltóanyagként. 15 Táptalaj: g szójababliszt 15,0 szárított őrölt burgonya 15,0 glukóz 50,0 CoCl2 .2H 2 0 0,005 20 CaCO 3 10,0 agar 2,5 desztillált vízzel kiegészítve 1000 ml-re. 3 ml S. olivacens szuszpenziót tartalmazó 100 ml ilyen táptalajt egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban forgó 25 rázógépen 25 C°-on 96 óra hosszat inkubálunk. A rázógép 5 cm lökettel percenként 280 fordulattal működik. 2. lépés Oltóanyag: 100 ml az 1. lépésből. 30 Közeg: ugyanaz, mint az 1. lépésben. 1000 ml táptalajt és oltóanyagot egy 4000 ml-es Erlenmeyer-lombikban 72 óra hosszat inkubálunk 25 C*-on lengő rázógépen. A rázógép 5 cm lökettel percenként 120 lengéssel működik. 35 3. lépés Oltóanyag: 1000 ml a 2. lépésből. Közeg: ugyanaz, mint az 1. lépésben. 30 liter táptalajt és oltóanyagot 38 literes fermentációs tartályban 96 óra hosszat 25 C*-on inkubálunk. Inkubálás közben a fermentlevet 40 keverjük és levegőztetjük percenként 0,6 méter felületi le vegő se be sséggel. 30,0 15,0 15,0 0,005 CaCOj 10,0 desztillált vízzel kiegészítve 1000 ml-re. Az oltóanyagot tartalmazó 250 liter táptalajt 96 óra hosszat inkubáljuk. Inkubálás közben a fermentlevet keverjük és levegőztetjük percenként 0,6 méter felületi levegősebességgel. . 3. példa A 2. példában leírt módon kapott 240 liter fermentlének tömény sósavval 6,0-ra állítjuk be a pH-ját, majd leszűrve 72,5 kg oldhatatlan micélium-szűrőlepényt és 190 liter szüredéket kapunk. 4. példa A 3. példában kapott 72,5 kg szűrőlepényt 3 ízben 100-100 liter metanollal extraháljuk. A lepényt az extrakciók között szűrőre visszük. Az egyesített metanolos kivonatokat a metanol eltávolítására vákuumban 13,5 literre koncentráljuk, és a kapott vizes szuszpenziót hozzáadjuk a 3. példában kapott 190 liter szüredékhez. .5. példa Az egyesített vizes fázist 3 ízben 70-70 liter vízzel telített etilacetáttal extraháljuk. Az egyesített etilacetátos kivonatokat vákuumban bepárolva mintegy 400 g barna g 4. lépés 15,0 Oltóanyag: 12 500 ml a 3. lépésből. 15,0 45 Táptalaj: 50,0 szójababliszt 0,005 szárított őrölt burgonya 10,0 glukóz 2,5 CoCl2 .2H 2 0 50 56 60 65 70 75 3
