162292. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteolitikus enzimek előállítására
23 162292 24 VIII. táblázat Faj Változat Törzs Enzimtipus Ca stabilizáció 1 a b c d C 300, C 301, C 360, C 372, C 374 C 302, C 334 C 323, C 339, C 352, C369 C 304, C 311, C 336 1 1 2 1 +++++ ' ++ +++ +++ II C 335, C 341 2 ++ III a b c d e f C 326, C 342 C 347, C 350 C 337, C 340 C 338, C 343, C 346, C 348, C 349 C 324, C 355 C 353 3 3 3 3 3 3 + + ++ + + IV a b c C 303, C 354, C 357, C 366, C 367, C 371, C 375, C 378 C 351, C 356, C 364, C 376, C 377, C 411 C 358, C 410 1 1 1 —+ V C 365, C 412 1 VI a b C 373 C 325, C 413 1 1 -VII C 370 1 — A VIII. táblázatban felsorolt törzsek által termelt enzimek proteolitikus aktivitását nemcsak 12-es pH-n vizsgáltuk, hanem alacsonyabb értékeknél is, hogy ezáltal is pontosabb 40 ismeretekkel rendelkezzünk az enzimek proteolitikus aktivitásáról különböző' kémhatásoknál, és jobban ismerjük a háromféle tipusu enzim aktivitását. A vizsgálatok eredményeit az 1-3 ábrákon tüntettük fel. Az 1. ábrán a C 311 számú törzs által termelt 1. típusban tartozó enzim proteo- 46 litikus aktivitását tüntettük fel. A 2. ábrán hasonló módon a C 335 számú törzs által termelt, a 2. tipusba tartozó enzim aktivitása látható. A 3. ábra a C 324 számú törzs által termelt, a 3 tipusba tartozó enzim proteolitikus aktivitását mutatja. 50 Az ábrán bemutatott aktivitásgörbék csupán elvi vázlatként mutatják be a háromféle tipusu proteolitikus enzim aktivitásának különbségét a különböző pH-értékeknél; az aktivitásgörbe alakja azonban változhat anélkül, hogy a görbe (alapvető jellegzetességei megváltoznának. 55 A találmány szerint előállíottt új enzimeket az alábbi vizsgálatoknak vetettük alá továbbá: a? Stabilitás tripolifoszfát-oldatban (TPP) Meghatároztuk az enzimek stabilitását 0,2% tripolifoszfátot tartalmazó oldatban. A stabilitás mértékének azt a 60 százalékos maradék-aktivitást tekintettük, amellyel az anyag 10-es pH-ju, 50 C°-os oldatban 30 perc után rendelkezett. Az enzim koncentrációja 0,1 Anson-egység/liter oldat volt. Az enzimtartalmat Anson módszerrel határoztuk meg. Az eredményt a IX. sz. táblázatban foglaltuk össze. 65 A 0,01 mólos CaCl2 -oldatban levő összehasonlító oldatok maradék aktivitása minden esetben 80-100% volt. b) Stabilitás nátriumperborát-oldatban Meghatároztuk az enzimet és a 0,1% nátriumperborátot m tartalmazó oldat aktivitását. A stabilitás mértékének a 10-«* pH-ju, 50 C*-os oldatban 30 perc után mérhető százalékos maradék-aktivitást tekintettük. Az alkalmazott enzimkoncentráció és az elemzés módszere egyezett az a.) vizsgálatban megadottakkal. 79 Az eredményeket a IX. táblázatban foglaltuk össze. 9?" •. -.'-•" • • * . c)Stabilitás felületaktivanyagokat tartalmazó oldatban Meghatároztuk az enzimanyagokat tartalmazó oldat J aktivitását. A vizsgálatok során három olyan tipikus felület\ aktív anyag- koncentrációt alkalmaztunk, mely a mosóoldatok koncentrációjának felelt meg. 1. Szappan 0,25 g/liter 2. DBS (alkil-arilszulfonát tipusu szer, 50%-os) 2,5 g/liter 3. TAS (zsíralkohol-szulfonát tipusu szer, 25%-os) 5,0 g/liter Az alkalmazott enzimkoncentráció 0,1 Anson-egység/liter volt. A vizsgálatokat 10-es pH.ju '50°-os oldatban végeztük, a vizsgálati idő 30 perc volt. Elemzési módszerként a nitrokazein módszert használtuk |l.E.v. Pechmann, Biochemische Zeitschrift, Bd. 321, 248-260 (1950)]. A IX. ábrához az alábbi magyarázatot fűzzük: A „stabilitás" rovatban a ferde vonal feletti számok az oldatban közvetlenül a felületaktív anyag hozzáadása után mért százalékos maradék-aktivitást adják meg. Ezek az értékek tehát az inaktiválódási folyamat kezdeti sebességéről tájékoztatnak. Ugyanebben a rovatban a ferde vonal alatti számok az előbbi kezdeti százalékos maradék-aktivitás és a 30 perc után mérhető százalékos maradék-aktivitás közti különbséget adják meg. Td)Optimális hőmérséklet A IX. táblázatban feltüntettük azt a hőmérsékletet, (C°) melynél 10-es pH-ju oldatban az aktivitás maximális volt. Az elemzést Anson-módszerrel végeztük. e) Az enzim típusa Azt találtuk, hogy a fenil-metil-szulfonilfluorid mindegyik enzimkészítményt pillanatszerűen és teljesen gátolja. Ez arra utal, hogy az enzimek aktív centrumukban szerint tartalmaznak. 12
