162200. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-glutamináz előállítására

162200 gyasztott sejttömeget ultrahanggal feltárt, és centrifugálással sejtmentes oldatot kapott. Ezt az oldatot DEAE-cellulóz-oszlopon kromatografálta, ammóniumszulfáttal való frakcionált kicsapásnak vetette alá, Sephadex-oszlopon kro- 5 matografálta, majd elekroforézissel tisztította, így 4,9 mg dúsított enzimet kapott, melynek aktivitása 1540 E/mg [lásd. J. Biol: Chem. 243, 853—863 o. (1968)]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy elvi okok miatt nehéz az enzimek 10 kémiájában használatos módszerekkel terápiás célokra alkalmas mennyiségű enzimet előállítani. Ennek az az oka, hogy a glutamináz oszlopkromatográfiás és elektroforézises elválasztása nem végezhető ipari méretekben. Az enzimek 15 többsége közismerten bomlékony, és ezért a fenti két módszer nélkül nem oldható meg dúsításuk. Az L-glutaminázzal kapcsolatos egyéb vizsga- 20 latokra vonatkozóan megemlítjük még a Chem. Abstr. 67, 88 473 y és 68, 10 434 n referátumot, ahol L-íiszparagináz és L-glutamináz indukciója • van leírva, valamint a Chem. Abstr. 69, 64 741 z referátumot, amely glutamináz ammóniumszul- 25 fátos frakcionálással való dúsításával foglalkozik. A Chem. Abstr. 70, 9 469 n referátumban glutaminszintetáz és glutamináz induktív képződéséről, míg a Chem. Abstr. 71, 27 983 a referátumban a Pseudomonas aureofaciens ATCC 30 13 985 mikroorganizmus törzs aszparagináz előállítására való alkalmazásáról olvashatunk. Azt találtuk, hogy a Pesudomonas aureofaciens ATCC 13 985 törzs intracellulárisan nagy 35 mennyiségben termel olyan L-glutaiminázt, amelynek minden egyéb ezideig alaposan megvizsgált L-glutaminázéitől eltérő tulajdonságai vannak. Ennek a Pseudomonas aureofaciens ATCC 13 985 törzs által termelt L-glutamináz- 40 mak az egyik meglepő, de nem előrelátható tulajdonsága abban áll, hogy a baktériumsejtekből egyszerű módszerekkel extrahálható és nagyipari méretekben dúsítható. Az ezideig megvizsgált L-glutaminázok leg- 45 fontosabbjainak egymástól eltérő tulajdonságait az alábbi vizsgálati eredmények szemléltetik: 1. A Pseudomonas aureofacines ATCC 13985 törzs által termelt L-glutamináz és a Pseudomonas GG 13 törzs által termelt L-glutamináz kö- 50 zötti különbségek [Ramadain, El Asmar, Greeneberg, Arch. Biochem. Biophys. 108, 143—149 oldal (1964)]. a) Az enzimhatás szempontjából optimális pH értékek eltérőek, és a pH 5,0 körül, valamint a 55 pH 9,0 körül ^mutatkozó einzimhatás-csökkenés is eltérő (lásd az ábrát). b) A Pseudomonas GG 13 által termelt L-glutamináz aktivitása 40 C°-on 15 perc alatt a felére csökken, ezzel szemben a Pseudomonas au- 60 reofacines által termelt L-glutamináz ugyanezen körülmények között teljesen stabilis. c) A Pseudomonas GG 13 törzs által termelt L-glutamináz az oldatokból hideg metanollal kicsapható. A Pseudomonas aureofaciens által ter- 65 melt L-glutamináz ilyen körülmények között inaktiválódák. 2. A Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 törzs által termelt L-glutamingáz és az emlős állatok által termelt L-glutamináz közötti különbségek [H. A. Krebs, Biochem. J., 29, 1951 (1935), J. D. Klingman, P. Handler, J. Biol. Chem. 232, 370 (1958), F. W. Sayre, E. Roberts, J. Biol. Chem., 23, 1128 (1958)]: a) A kutyaveséből származó L-glutamináz pH optimuma 7,9 és 8,1 között van. Az enzim pH 6,0-nál teljesen inaktív. A Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 törzs által termelt L-glutamináz enzimaktivitásának maximuma pH 7,5-nél figyelhető meg, míg pH 6^nál a maximális enzimaktivitás 80%-a tapasztalható (lásd az ábrát). b) A nátriumklorid az emlős állatokból származó glutaminázt gátolja, a Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 által termelt glutaminázt viszont nem. c) Az emlős állatokból származó glutamináz több értékű ionokat nem tartalmazó vizes oldatban gyorsan elveszti aktivitását, a Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 törzs által termelt enzim aktivitása ezzel szemben megmarad. 3. A Clostridium welchii által termelt L-glutamináz és a Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 által termelt L-glutamináz közötti különbségek [Hughes, D. E. Williamson, D. H., Biochem. J., 51, 45. o. (1951)]: A Clostridium welchii által termelt L-glutamináz aktivitása pH 5-nél optimális, ebben feltűnően különbözik ez az enzim a Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 által termelt glutamináztól (lásd az ábrát). 4. A Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 által termelt L-glutamináz és az E. Coli B által termelt L-glutamináz közötti különbségek [Hartmann, S. C, J. Biol. Chem. 243, 853 o. (1968); Meister és munkatársai, J. Biol. Chem., 215, 441. o. (1955)]: a) A Coli B által termelt glutamináz aktivitásának pH 5-nél optimuma van, pH 7-től kezdve meredeken csökken az aktivitás. b) A Coli B-glutamináznak nincs L-aszparagináz-aktivitása. A Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 által termelt L-glutamináz aktivitása ezzel szemben mintegy 60%-os mértékben a szubsztrátra fajlagos, azaz tökéletesen azonos kísérleti körülmények között a Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 által termelt enzim L-aszparaginból kb. a 60%-át teszi szabaddá annak az ammónia mennyiségnek, amelyet az L-glutaminból képes szabaddá tenni. A különféle L-glutaminázok között fennálló, a fentiekben szemléltetett különbségek azt bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárással a Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 alkalmazásával előállított glutamináz olyan fehérje, amelynek enzim-tulajdonságai természetesen nem térnek el az eddig ismert glutaminázokétól, de egyéb, kémiai tulajdonságai igen. A találmány szerinti eljárásban használt Pseu-2