162200. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-glutamináz előállítására
162200 domonas aureofaciens törzset H. Bouman különítette el 1936-ban. A mikroorganizmus telepeiben pigmentkristályok képződnek, és a szilárd táptalajon tenyésztett kultúra aranysárga szint vesz fel. A további vizsgálatok során kiderült, hogy a Pseudomonas aureofaciens többféle pigmentet is képez a táptalaj összetételétől és egyéb külső körülményektől függően. Két pigment fenazin-származéknak bizonyult, egyikük fenazin-<T-kiarbonsav. Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti eljárást az L-glutamináz Pseudomonas aureofaciiens ATCC 13985 alkalmazásával való előállítására. Egy L-glutamkiáz-egység alatt az enzimnek azt a mennyiségét értjük, amely 37 C° hőmérsékleten és 7,4 pH-jú közegben 1 perc alatt 1 ju mól ammóniát képes az L-glutaminázból lehasítani. Ipari méretekben úgy állíthatunk elő kielégítő termeléssel L-glutaminázt, hogy Pseudomonas aureofaciens ATCC 13985 törzset tenyésztünk az alábbi összetételű, pH 7,0-re beállított tápoldatban, 30 C°-on való levegőztetéssel: L-glutaminsav 0,8% glicin 0,6% K2 HP0 4 0,115% KH2 P0 4 0,063% MgS04 0,014% PeS04 0,0006% MnS04 0,0006% NaCl 0,0006% tejsav 0,3% Rázókultúrábam 17—20 órás tenyésztéssel 8E/cm3 L-glutamiináz-tartalmú oldatokat kapunk. Ha a fenti baktériumtörzset abban a tápoldatban tenyésztjük, amelyet Ramadan, El Asmar és Greeneberg a Pseudomonas GG 13 tenyésztésére használtak, akkor a kapott oldat enzim-tartalma csak 2 E/ml. Ha pedig Pseudonomas GG 13 törzset tenyésztünk a találmány szerinti tápoldatban, az oldat L-glutamináz-aktivitása 1,6 E/ml, a fenti szerzők által leírt tápoldatban való tenyésztéssel mindössze 0,8 E/ml enzim aktivitású oldatot kaptunk. A rázókultúrákra vonatkozóan fent leírt tenyésztési módszer alkalmazásakor azt tapasztaltuk, hogy a pH-érték a tenyészidő alatt pH 7,0-ről a lúgos tartomány irányában eltolódik, és a baktériumok maximális elszaporodásakor az oldat pH-ja 8,0—8,2. Laboratóriumi méretben, üveg fermentorban végzett kísérletekben azonban az oldat pH-értéke már akkor elérte a 8,0-at, amikor a kultúra növekedése a rázókultúrában elérhető mértéknek csak a 35%-át érte el. Ha akkor folytattuk a tenyésztést, a pH-érték további növekedésének már az volt a következménye, hogy a tenyészet gyakorlatilag nem nőtt. Az így kapott oldatok L-glutamináz-aktivitása csak mintegy 3 E/ml volt. Ha a fermentlevekhez attól kezdve, hogy a pH-értékük 7,7-re emelkedett, rövid időközönként annyi hígított sósavat adtunk, amennyi elegendő volt a 7,5—7,7 pH-érték fenntartására, a mikroorganizmusok szaporodását gátló hatást kiküszöböltük, de az oldat L-glutamináz-tartalma még sem növekedett. Ha azonban a fermentlebe CO2 gázt vezetünk be, meglepő módon nem csak a baktériumkultúra 5 növekedése fokozódik, hanem az L-glutaminázaktivitás is mintegy 8 E/ml-re növelhető. A tenyész-oldatot centrifugáltuk, majd a baktériumszedimentumot, amely az L-glutamináz teljes mennyiségét magában foglalja, kevés vízben új-10 ra szuszpendáltuk, acetonnal, kicsapattuk, tiszta acetonnal mostuk és vákuumban szárítottuk. Az így kapott sejttömeg glutamináz-tartalma 1—2 E/mg. E sejttömegből pufferoldattal való extrahálással nyers enzimet kaphatunk. A pH 15 beállításának nincs jelentősége; csak azért célszerű az extrakciót pH 5-nél végezni, mert gyengén savas közegben könnyebb a sejttömeget centrifugálással elkülöníteni. A kivonatokból 4 —5 E/mg aktivitású nyers L-glutamináz külö-20 níthető el, ha a kicsapatást acetonnal vagy a frakcionálásra alkalmas diolokkal és/vagy poliéterekkel végezzük. A további dúsításra különösen alkalmasnak találtuk azt a módszert, mely szerint a szuszpenzióhoz szakaszosan adunk dio-25 lókat és/vagy vízben oldhatatlan poliétereket, és az akkor kiváló csapadékot elkülönítjük. E célra azok a 4—8 szénatomos, vízben oldható diolok alkalmasak, melyeknek egy hidroxil-csoportjuk alkilezhető, pl. az izomer bután-diolok, az 1,5-30 -pentándiol, a 2,5-hexándiol, a 2-metilpentán-2,4-diol, a 3-metoxibutanol, stb. A többértékű éterek közül a 400 és 6000 közötti molekulasúlyú polialkilénglikolokat találtunk alkalmasaknak. A módszer kivitelezésénél 35 célszerű különböző oldószerekkel, pl. polialkilénglikolokkal való frakcionálási végezni. A frakcionálás eredményessége szempontjából nincs döntő jelentősége a hidrogénionkoncentrációnak, de a pH 4 és pH 9 közötti tartományon belül 40 kell dolgoznunk, mert az enzim vizes oldatba csak e tartományon belül stabil. A találmány szerinti eljárással kapott L-glutamináz izoelektromos pontja 7 és 8 között van. Ebben a tartományban a legcsekélyebb a vízben való old-45 hatóság, és ezért ez az a pH-érték, amelyen viszonylag kevés kiesapatószerrel végezhető a kicsapatás. Az enzim a sejtekben sok más fehérje mellett fordul elő. A többi fehérje befolyásolja a kívánt 50 frakció kicsapási határait és oldhatóságát. A technika jelenlegi állása szerint a nyers glutamináz előállításakor nem lehet azt elérni, hogy a nem kívánatos kísérőanyagok részaránya mindig azonos legyen, ezért gyártási tételenként a ki-55 csapás határa kissé eltérhet. Előzetes kísérletekkel könnyen meg lehet határozni a kicsapás legkedvezőbb határait. Ha a kísérő fehérjék menynyisége ingadozik, szükségessé válhat a hidrogénhíd kötéseket felbontani képes amidok hoz-60 záadásával való eltávolításuk a frakcionálás szelektívebb tétele céljából. A következő ámidok használhatók erre a célra: barbamid, guanidin, formamid, stb. A találmány szerinti eljárásnak az alábbi elő-65 nyei vannak az eddig ismert eljárásokkal, pl. az 3
