162135. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a polimixinekből származó ciklusos polipeptidek előállítására
162135 9 10 Rf = 0,61 (kovasavgélen; 5:95 térfogatarányú metanol-l,2-diklór-etán eleggyel). Ugyanígy dolgozva, de 2,46 g 2-hidroximetil-6-metil-piridinből és 4,03 g p-nitrofenilklórformiátból kiindulva 1,30 g vegyes (6-metil-2-piri-dil-metil)-(p-nitrofenil)-karbonátot kapunk. Rf = 0,83 (kovasavgélen; 5:15:5:10:15 térfogatarányú butilmeitilketon-aceton-ecetsav-piridin-ciklohexán rendszerben). 13. példa 280 mg kolisztinniek 15 ml dimetilformamiddal készült szuszpenziójához hozzáadunk 450 mg vegyes (6-metil-2-piridil-metil)-p-nitrofenil-karbonátot. 20 C°-on való 64 órai keverés után az oldatot 0,3 torr nyomáson 55 C°-on szárazra pároljuk. Az üvegszerű maradékhoz 10 ml étert adunk, és a keletkező kristályokat szűréssel elválasztjuk, és 3 ízben 20 ml éterrel mossuk. Így 92 mg penta-N-[(6-metil-2-piridil)-metoxikarbonil]-kolisztint kapunk. Rf = 0,91 (kovasavgélen; 50:20:6:24 térfogatarányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz rendszerben). 14. példa 400 mg kolisztinnek 25 ml dimeitilformamiddal készült szuszpenziójához hozzáadunk 900 rag vegyes (4-piridil-metil)-(p-nitrofenil)-karbonátot. 20 C°-on való 64 órai keverés után az oldatot 0,3 torr ínyomáson 55 C°on szárazra pároljuk. Az üveges maradékhoz 20 ml étert adunk, a keletkezett kristályokat szűréssel elválasztjuk, 3 ízben 20 ml éterrel mossuk, és 0,3 torr nyomáson 20 C°-on megszárítjuk. Így 620 mg penta-N-(4-piridil-metoxikarbonil)-kolisztint kapunk. Rf = 0,74 (kovasavgélen; 50:20:6:24 térfogatarányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz rendszerben). 15. példa 1,25 g 4-hidroximetil-piridin-N-oxidnak 20 ml piridinnel készült 0 C°-ra hűtött oldatához hozzáadunk 2,02 g p-nitrofenil-klórformiátot. Ezután a reakciókeveréket további 17 óra hosszat kb. 20 C°-o>n keverjük. A kivált csapadékot szűréssel elválasztjuk, 2 ízben 4—4 ml piridinnel mossuk, és 0,3 torr nyomáson 20 C°-an megszárítjuk. Ily módon 0,67 g (N-oxido-4-piridil-metil)-(p-nitrofenil)^karbonátot kapunk. összetétel: számított: C 53,80%, H 3,47%, N 9,65% talált: C 52,90%, H 3,70%, N 9,68% A kiindulási terméket a 4. példában leírt módon kapjuk 2,72 g 4-hidroximatil-piridinből és 5,49 g p-nitroperbenzoesavból kiindulva. Ily módon 1,74 g 4-hidroximetil-piridin-N-oxidot kapunk. Olvadáspontja Kofler-blokkon 125 C°. összetétel: számított: N-*0 12,8% talált: N- O 13,0% 17. példa 1,5 g penta-N-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-kolisztinnak 230 ml 7,5 pH-ra pufferolt, 37 C°-ra melegített oldatához hozzáadunk 50 ml sízubtilizint, és a reakciókeveréket 37 C°-on 15 percig keverjük. Rögtön utána a reakciókeveréket —70 C°-ra hűtjük. Liofilizálással krémszínű port kapunk, ezt feloldjuk 800 ml n-butanolból, 200 ml piridinből, 100 ml ecetsavból és 900 ml vízből álló oldószerrendszer nehéz fázisából vett 10 ml oldószerben. Az így kapott oldatot ellenáramú megosztásnak vetjük alá egy 60-csöves készülékben, amelynek minden csöve a fenti oldószerrendszerből vett 10 ml nehéz fázist és 10 ml könnyű fázist fogad be. A megosztás befejeztével minden cső tartalmát 25 torr nyomáson 60 C°-on bepároljuk. A 25—31. csövekből kapott maradványokat feloldjuk összesen 20 ml vízben, és ezt az oldatot liofilizáljuk. Így 246 mg ciklo- [N}»-L-a,y-diaminobutiril- Ny-(N-oxido-3-piridil-rnetoxikarbonil)-L-a,7-diaminobuti!ril-D-leucil-L-leucil-Nj/-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil-L-a,y-diaminobutiril-Ny-(N-oxido-3-pir:idil-me!toxik'arbonil)-L-a,7-diaminobutiril-L-treonil]-t kapunk. Rf = 0,27 (kovasavgélen, 50:20:6:24 arányú n-butanol-piridin-ecetsav-víz rendszerben). Teljes hidrolízis után Technicon automatikus analizáló készülékben megelemezve a következő aminosavak jelenlétét állapítottuk meg: Dab = 4,07 (elméleti = 4) Leu = 2,00 (elméleti = 2) Thr = 0,98 (elméleti = 1) Analóg módon eljárva, de a szubtilizint nagarsszal, pronázzal, kolisztinázzal, alkalázzal vagy a B. subtilis GLAXO 417, B. subtilis ATCC 9524 és B. subtilis THE 4 által termelt proteázokkal helyettesítve ugyancsak a fent leírt ciklikus polipeptidet kapjuk, amint azt kovasavgélen végzett ikromatografálással (Rf = 0,27) 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16. példa 200 mg kolisztinnak 10 ml dimetilformamiddal készült szuszpenziójához hozzáadunk 400 mg (N-10 -oxido-4-piridil-metil)-(p-nitrofeinil)-karbonátot. Kb. 20 C°-on való 64 órai keverés után az oldatot 55 C°-on 0,3 torr nyomáson szárazra pároljuk. Az üveges maradékhoz 10 ml étert adunk, a képződő kristályokat szűréssel elvá-15 lasztjuk, 2 ízben 3—3 ml éterrel mossuk, és 0,3 torr nyomáson 20 C°-on megszárítjuk. így 250 mg penta.-N-(N-oxido-4-piridi,l-metoxikarl bonil)-kolisztint kapunk. Rf = 0,29 (kovasavgélen; 50:20:6:24 térfogatarányú n-butanol-piridin-20 -ecetsav-víz rendszerben). 5
