162135. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a polimixinekből származó ciklusos polipeptidek előállítására

162135 11 12 50:20:6:24 térfogaitarányú n-butanol-piridin-eoetsav-víz rendszer alkalmazásával sikerült kimutatni. A penta-N-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-kolisztin feloldására használt 7,5 pH-ra pufferolt oldat elkészítésére 34 ml ecetsavnak 700 ml desztillált vízzel készült oldatát 5 n vizes ammóniaoldat hozzáadásával beállítjuk 7,5 pH-ra (pH-mérővel meghatározva), majd desztillált vízzel kiegészítjük 1000 ml térfogatra. 18. példa 5 g penta-N-(N-oxido-3-piridil-metiloxikarbonil)-kolisztinnek 1 liter 6 pH-ra pufferolt oldattal készült oldatához hozzáadunk 500 mg B. subtilis által termelt alkalikus proteázt (titer: 9,5 E/ mg) és a reakciókeveréket 21 C°-on 3 óra hoszszat keverjük. Rögtön ezután a reakciókeveréket n sósav hozzáadásával beállítjuk 3 pH-ra. Az így kapott oldatot liofilizálva krémszínű port kapunk, ezt feloldjuk 80 ml metanolban. Az oldhatatlan részt szűréssel eltávolítjuk, majd a szüredéket 20 torr nyomáson 50 C°-on szárazra pároljuk. Az így kapott 5,9 g maradékot feloldjuk 30 ml 75:25 térfogatarányú etanol-metanol elegyben, és az oldatot 320 g semleges alumíniumoxidból készült oszlopon kromatografáljuk (az oszlop magassága 70 cm, átmérője 2,8 cm). Sorban eluálunk 1 liter 75:25 térfogatarányú etanol-metanol eleggyel, 4,5 liter 50:50 térfogatarányú etanol-metanol eleggyel és végül 3,5 liter metanollal, miközben 500—500 ml-es frakciókat fogunk fel. A 10—21. frakciókat egyesítjük, és 20 torr nyomáson 50 C°-on szárazra pároljuk. Ily módon 1,55 g eiHio-[Ny-L-a,}>-diam.inobutiril-Ny-(N-oxido-3-piridil-metiloxiíkarbonil)-L-a,y-diammobutiril-D-ieucil-L-leucil-Ny-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)-L -a,y-diaminobutiril-Ny-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonilJ-L-a^-diaminobutiril-L-treonilJ-t kapuink. A pentar-N-(N-oxido-3-piridil-metiloxikarbonil)-kolisztin feloldására használt 6 pH-ra pufferolt oldat elkészítésére 454 mg káliumdihidrogénfoszfátot feloldunk 1 liter desztillált vízben, amelyet 1,2 g dinátriumhidrogénfoszfátdodekahidrát 1 liter desztillált vízzel készült oldatának hozzáadásával 6 pH-ra (pH-mérővel meghatározva) állítottunk be. Az enzim egysége az az enzimmennyiség, amely 9,5 pH-nál és 50 C°-on 1 perc alatt kazeinből annyi triklórecetsavban oldható pepiidet szabadít fel, amennyi az optikai sűrűséget 280 nm-nél 1,00 egységgel növeli. Ennélfogva az enzim titere (E/mg) az egységek száma 1 mg anyagban. Az enzimatikus aktivitás meghatározásának ez a módszere az M. Kunitz [J. Gen. Physiol. 30, 291 (1947)] által leírt módszeren alapul. 19. példa 10 g penta-N-(N-oxido-3-piridil-metoxikarbonil)~kolisztinnak 2 liter 6 pH-ra pufferolt oldat-5 tal készült oldatához 3 g B. subtiilis által termelt alkalikus proteázt (titer 9,5 E/mg) adunk, és a reakciókeveréket 21 C°-on 3 óra hosszat keverjük. Rögtön ezután a reakciókeveréket n sósav hozzáadásával 3 pH-ra állítjuk be, és az oldhatatlan részt szűréssel eltávolítjuk. Az így kapott oldatot liofilizálva 14,6 g krémszínű port kapunk, ezt feloldjuk 200 ml desztillált vízben, az oldathoz 200 ml hidroxilfázisban levő Dowex 1X2 ioncserélő gyantát adunk, a keveréket 1 óra hoszrszat keverjük, szűrőre visszük, a gyantát 600 ml desztillált vízzel mossuk, és a vizes fázist liofilizáljuk. Így 8,5 g krémszínű port kapunk, ezt 150 ml metanolban oldjuk, az oldatot V2 óra hosszat keverjük, az oldhatatlan részt szűréssel elválasztjuk, és 3 ízben 50—50 ml metanollal mossuk. A szüredéket 20 torr nyomáson 50 C°-on szárazra pároljuk. Az így kapott 8,1 g maradékot 20 ml 95:5 térfogatarányú metanol-dioxán oldatban oldjuk, és az oldatot 138 g kovasavgélből készült oszlopon (magassága 75 cm, átmérője 2,2 cm) kromatografáljuk. 95:5 térfogatarányú metanol-dioxán eleggyel eluálunk, és 50—50 mles frakciókat fogunk fel. A 22—60. frakciókat egyesítjük, és 20 torr nyomáson 50 C°-on szárazra pároljuk. így 3,25 g ciklo-[Nj/-L-a,y-diaminobutiril-Ny-(N-oxido-3-pirid;il-metoxikarbonil)-L-a,y-diaminobutiril-D4eucil-L-leucil-Ny--(N-oxido-3-piridil-metoxiikarbonil)-L-a,y-diaminobutiril-N)'-(N-oxido-3-piridil-'metoxikarbonil)-L-a,y-diaminobutiril-L-treonil] -t kapunk. Az ebben a példában használt 6 pH-ra pufferolt oldat a 18. példában leírt módon készül, és az enzim titerének definíciója azonos a 18. példában megadottal. 20. példa 45 » 3,17 g penta-N-(N-oxido-3-piridil-imetoxikarbonil)-polimixin B-nek 634 ml 6 pH-ra pufferolt oldatához hozzáadunk 1,02 g B. subtilis által termelt alkalikus proteázt (titere 9,5 E/mg), és a 50 reakciókeveréket 22 C'°-on 3 óra hosszat keverjük. Rögtön ezután a reakcióké véreket n sósav hozzáadásával beállítjuk 3 pH-ra, Az oldhatatlant szűréssel eltávolítjuk, majd a szüredéket 20 torr nyomáson 50 C°-on szárazra pároljuk, Az így 55 kapott krémszínű port 60 ml desztillált vízben oldjuk, és az oldathoz 60 ml hidroxilfázisban levő Amberlite IRA 400 ioncserélő műgyantát adunk. A keveréket 1 óra hosszat keverjük, szűrőre visszük, a gyantát 200 ml desztillált vízzel 60 mossuk, és a vizes fázist liofilizáljuk. A maradékot 50 ml metanolban oldjuk, az oldatot V2 óra hosszat keverjük, az oldhatatlan részt szűrőre visszük, és 3 ízben 15 ml metanollal mossuk. A szüredéket 20 torr nyomáson 50 C°-on szárazra 65 pároljuk. A maradékot 5 ml 95:5 térfogatarányú 15 20 25 30 35 6