161900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anti-alfa1-fetoglobulin tartalmú, elsődleges rákos májdaganat diagnosztizálására alkalmas szer előállítására

161900 15 16 bevont Amberlite IR45-öt még kétszer centrifugáljuk a fent megadott pufferoldattal, amelyhez 0,3 s/tf% albumint és 0,1 s/tf% nátriumazidot adunk. Mosás után a hordozóra felvitt anti-iai-fetoglobulint diszpergáljuk kb. 90 ml pontosan 8,2 pH-ra beállított-fent megadott öszszetételű pufferoldatban. További puffert adunk hozzá 100 ml összes térfogatig. 9. példa: 5 ml triiszHhiidroklorád-aiátriiuimikliorid pufferoldatban (8,2 pH) diszpergálunk 1,5 g porított, 1,3 t* méretű tisztított Amberlite IRA411 műgyantát, majd optimális mennyiségű frakcionált anti-cti-fetoglobulint és 0,01 g patentkéket. A rendszert 4 °C-on 2 óra hosszat rázzuk, miközben az anti-oti-fetoglobulin adszorbeálódik. Centrifugálunk, majd a kapott anti-íoi-fetoglobulin-Amberlite IRA411 keveréket ismét kétszer centrifugáljuk, ugyanazt a pufferoldatot használva, de 0,ö% is/itdB%. nominális házinyúl szérummal és 0,1 s/tf% nátriumaziddal kiegészítve. Mosás után a csapadékot kb. 90 ml fenti összetételű pufferoldatban diszpergáljuk, és beállítjuk pontosan 0,5 pH-ra. További pufferoldattal kiegészítjük a diszperziót 100 ml-re. 10. példa: 8 ml nátriumklorid-foszfát pufferoldatban (8,5 pH) 0,25 g 0,8 /* részecske méretű polisztirolt látexet diszpergálunk, majd hozzáadunk optimális mennyiségű anti-wi-fetoglobulin szérumot. A keveréket 37 °C-on 1 óra hosszat rázzuk, mire az anti-jOi-fetoglobulin adszorbeálódik a hordozón. Ezután a keveréket centrifugáljuk, és a keletkezett anti-xxi-fatoglobulin-látexet 2 ízben centrifugáljuk, ugyanazt a puffert használva, mint fent 0,1 s/ltf% nátriumazid adalékkal. Mosás után az anti-Wi-fetoglobulin-látexet diszpergáljuk kb. 90 ml fenti pufferoldatban, és a diszperziót beállítjuk 8,5 pH-ra. Ezután ugyanezzel a puffierrel feltöltjük a diszperziót 100 ml-re. 11. példa: Kaolinból frakcionált kicsapással 1—3 p szemcseméretű frakciót készítünk, és ebből 2 g-ot diszpergálunk 10 ml nátriumklorid-borát pufferoldatban, majd hozzáadunk optimális mennyiségű anti-icti-fetoglobulint és 0,01 g brillantkék FCF-et. A keveréket 4 °C-on. 2 óra hosszat rázzuk, mire az anti-tcti-fetoglobulin adszorbeálódik a kaolinon. Az anti-ai-fetoglobulin-kaolint 2 ízben mossuk ugyanazzal a pufferoldattal, amely adalékként még 0,5 s/tf% Tween 80-at és 0,01 s/tf% Thimerosalt tartalmaz. Ezt a keveréket további kb. 90 ml ugyanolyan puffer hozzáadásával beállítjuk 6,5 pH-ra. Végül ugyanazzal a pufferral feltöltjük 100 ml-re. Anti-eci-fetoglobulin előállítása 12. példa: 5 Egy primer hepatomas beteg 1 sr. szérumához 2 sr. 0,03 mólos cinkacetát oldatot adunk, majd feloldjuk etanolban. A 28 tf/tf%-os etanolos oldatot beállítjuk 6,4 pH-ra, és —5 °C-on 14 óra hosszat állni hagyjuk. Az oldatot centrifugáljuk, 10 a folyékony fázishoz 0,02 mólos báriumacetát oldatot adunk, majd 25 tf/ffcf°/o-os etanolos oldatot készítünk, és beállítjuk 6,7 pH-ra. Az oldatot —5 °C-on 2 óra hosszat állni hagyjuk, majd centrifugáljuk. A folyékony fázisból 40 15 tf/tf%-os etanolos oldatot készítünk, és azt —5 °C-on 2 óra hosszat állni hagyjuk. Az oldatot centrifugáljuk, és a folyékony fázisból 40 tf/tf %TOS etanolos oldatot készítünk, azt —10 °C-on 14 óra hosszat állni hagyjuk, majd a beletke-20 zett csapadékot szűréssel elválasztjuk. A csapadékot nátriumcitrát-oldatban oldjuk, és az oldatot vízzel szemben 4 °C-on néhány napig dializáljuk, majd a dializátumot liofilizálva megkapjuk az antigént. 25 Ebből az antigénből meghatározott mennyiséggel házinyulakat immunizálunk, és amikor az antigén titer elérte a kívánt szintet, a házinyulakat kivérezftetjük, és a szérumot elválaszd 30 juk. Ehhez a szérumihoz 0,i2 tf nonmális emberi szérumot adunk, és a keveréket 37 °C-on 1 óra hosszat, majd 4 c

C-on éjjelen át állni hagyjuk. Következő nap a keveréket centrifugálva megkapjuk a kívánt antwzi-fetoglobu-35 lin szérumot. Végrehajtjuk a fent leírt műveletet azzal a különbséggel, hogy emberi szérum helyett immunoadszorbenst használunk, és így ugyanarra 40 az eredményre jutunk. Az immunoadszorbens a következőképpen készül. 10 ml normális emberi szérumot acetátpufferoldattal beállítunk 5,5 pH-ra. Hozzáadunk 1,0 45 ml glutáraldehidet, és 3 óra hosszat állni hagyjuk. Foszfátpuffer-oldat hozzáadása után centrifugáljuk, és a csapadékot összegyűjtjük. A csapadékot a fenti puffer-oldattal néhány ízben mossuk, majd a puffer-oldatban szuszpendáljuk. 50 13. példa: Egy beteg 1 rész szérumához 1 rész 0,1 mólos nátriumklorid-foszfátpuffer-oldatot (7,2 pH) 55 adunk, majd fokozatosan hozzáadunk keverés közben 2 rész telített vizes ammóniumszulfátoldatot, mire csapadék válik ki. A keveréket 4 °C-on éjjelen át állni hagyjuk, majd percenként 8000 fordulattal 20 percig centrifugáljuk. 60 A folyékony fázist vízzel szemben 4 °C-on néhány napig dializáljuk, majd a dializátumot liofilizálva megkapjuk a kívánt antigént. Ezzel az antigénnel kecskét immunizálunk, 65 majd elvégezzük a 12. példában leírt művele-8