161900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anti-alfa1-fetoglobulin tartalmú, elsődleges rákos májdaganat diagnosztizálására alkalmas szer előállítására

161900 17 18 tekét. A kapott antiszérumot 0,35 tf normális emberi szérummal keverve megkapjuk a kívánt anti-«i-fetoglobulin szérumot. 14. példa: Egy primer hepatomas beteg hasvízéből 5 inl-it feltoltunk egy 3 cm átmérőjű és 100 cm hosszú Sephadex G—200 oszlopra, majd azt 0,1 mólos trisz-HCl-nátriumklorid pufferral (8,0 pH) eluáljuk 20—25 ml/óra ütemben. A ,y-globulintól (2. csűcs) albuminig (3. csúcs) terjedő frakciókat elrendezzük Ouchterlony módszere szerint az iűti-fetoglobulin frakció kiválasztására. Ezt a frakciót, külső fázisként vizet használva, 4 °C-on néhány napig dializáljuk, és a dializátumot szivatással koncentráljuk kollódiumzsák használatával a kívánt antigén kinyerésére. Ezzel az antigénnel házinyulakat immunizálunk, majd elvégezzük a 12. példában leírt műveleteket. A kapott antiszérumot 0,2 tf normális emberi szérummal keverve megkapjuk a kívánt anti-iai-fetoglobulin szérumot. 15. példa: A 14. példában leírt módon előállított antigént tovább tisztítjuk izoelektromos frakcionáló készülékben. Az antigént 0,5 tf/itf% 3—10 pH-jú hordozó amfolitot tartalmazó szacharóz-gradiens oszlopra töltjük, és az oszlopot 4 °C-on tartva 700 V-os áramot alkalmazunk 2 napig. Az elválasztás után a 4,2—4,5 pH-s frakciókat egyesítjük, és 4 °C-on néhány napig dializáljuk vízzel szemben. Ezután a dializátumot szivatással koncentráljuk kollódiumzsák használatával a kívánt antigén kinyerésére. Ezt az antigént házinyulak immunizálására használjuk, majd elvégezzük a 12. példában leírt műveleteket. A kapott antiszérumot 0,1 tf normális emberi szérummal keverve megkapjuk az antinai-fetoglobulin szérumot. ai-Fetoglobulin előállítása 16. példa: Egy primer hepatomas beteg 50 ml hasvizét vízzel felhígítjuk négyszeres térfogatra, és ä hígított folyadékot dializáljuk 5 liter 0,1 s/tf%,-os akrinol-oldattal szemben 24 óra hosszat. Az akrinol-oldatot percenként 4000 fordulattal centrifugáljuk, és a csapadékot rázás közben 50 ml fiziológiai sóoldatban oldjuk. Az oldatot ismét centrifugáljuk percentként 4000 fordulattal. A folyékony fázist acetátpuff er-oldattal (0,04 mól, 5,0 pH) dáializáljuk, és a dializáturaot feltöltjük egy karboximetilcellulóz oszlopra (0,04 mól, 5,0 pH), és azt 0,2 mólig eluáljuk. Minthogy az «i-fetoglobulin kb. 0,055 mólnál kezd eluálódni, ezt a frakciót összegyűjtjük. Ezt a műveletet kétszer megismételjük egyetlen «i-fetoglobulin frakeió nyerésére. Az »i-fetoglobulin titere az eredeti hasvízben 3142 E/ml (50 ml), a végső titer 600 E/ml (200 ml), ami megfelel 70 s/tf% hozamnak. Az eredeti albumintartalom 7,623 mg/ml (50 ml), a 5 végső lépésben viszont nem sikerül albumint kimutatni az immunolemezzel. 17. példa: 10 Egy primer hepatomas beteg 50 ml hasvizét vízzel négyszeres térfogatra hígítjuk, és 5 liter 0,05 s/tf/oros akrinol-oldattal szemben 24 óra hosszat dalizáljuk. A dializátumot percenként 3000 fordulattal centrifugáljuk, és a csapadé-15 kot rázás közben 50 ml fiziológiai sóoldatban oldjuk. Az oldatot ismét centrifugáljuk 3000 fordulattal. A folyékony fázist trisz-hidroklorid-nátriumklorid-pufferral (0,03 mól, 4,5 pH) szemben dializáljuk, és a dializátumot feltöltjük egy 20 DEAE-cellulóz oszlopra (0,04 mól, 4,5 pH), és 0,i2 mólig eluáljuk. Az eluátuimat hasonló módon egy karboximetilcellulóz oszlopon kezelve egyetlen ea-íetoglobulin frakciót kapunk. Az eredeti hasvíz ai-fetoglobulin titere 2500 25 E/ml, (50 ml), viszont a végső titer 400 E/ml (180 ml),' ami megfelel 60 s/tf% hozamnak. Az eredeti albumintartalom 7,915 mg/ml (50 ml), viszont a végső lépésben immunolemezzel nem sikerül albumint kimutatni. 30 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás primer hepatomát diagnosztizáló 35 szer előállítására, azzal jellemezve, hogy egy primer hepatomában szenvedő betegtől vett hasvízzel vagy szérummal, adott esetben annak megtisztítása után, egy állatot immunizálunk, az állatból vért veszünk, a vérből kiválasztjuk 40 a szérumot, azt emberi szérummal vagy immunoadszorbenssel adszorbeáltatva eltávolítjuk a szennyezéseit, és az így kapott anti-«i-fetoglobulint egy tartó közegben eloszlatjuk, és azzal együtt megdermesztjük vagy egy hordozóval 45 adszorbeáltatjuk. (Elsőbbsége: 1970. július 29.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a betegtől vett hasvizet vagy szérumot eyy protein fräk-50 cionálási művelettel, nevezetesen Cohn-féle frakcionáló módszer Spira-féle módosított változatával ammóniumszulfátos frakcionálással, gélszűréssel, oszlopkromatografálással, izoelektromos frakcionálással, elektroforézissel vagy 55 membránszűréssel tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1970. július 29.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a betegtől vett hasvizet vagy szérumot akrinollal, előnyö-60 sen 0,01—0,1 s/tf%-os vizes akrinololdattal szemben dializálva tisztítjuk, majd a dializátumból kapott csapadékot protein friakcionálással tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1970. augusztus 28.) 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás fogänato-65 sítási módja, megdermedt tartó közegben oldott 9