161849. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A16886 antibiotikumok előállítására
3 161849 4 ból számítva a molekulasúlya kb. 530; 40,26% szenet, 5,91% hidrogént, 13,98% nitrogént, 33.37% oxigént és 7,21% kenet tartalmaz; fajlagos optikai forgatóképessége [ice]2 ^ = +153,6° (c — 1 súly/tf/o vízben); ásványolajos szuszpenzióban infravörös abszorpciós spektrumában a következő hullámhosszaknál ad jellemző sávokat (mikronban kifejezve): 3,10, 5,68, 6,30, 6,60, 7,20, 7,60, 8,83, 9,35, 9,60, 9,85, 11,60, 12,90. Ugyancsak a találmány oltalmi körébe tartozik az eljárás A16886II antibiotikum kinyerésére az említett fermentléből, mely antibiotikum ammóniumsója fehéres, pelyhes, amorf anyag; 190 és 300 °C között lágyul, miközben sötétbarna színű lesz; vízben igen jól oldódik, rövidszénláncú alifás alkoholokban gyengén, acetonitrilben egyáltalán nem oldódik; amfoter jellegű, négy titrálható csoporttal rendelkezik, melyek pK'-értékei: pK'ai = 4,0; pK'a2 = 5,3; pK'a:) = 9,2 és pK'a 4 = 10,5; a titrálási adatokból számítva molekulasúlya kb. 528; hozzávetőleges összetétele 41,01% szén, 5,64% hidrogén, 15,75% nitrogén, 29,28% oxigén és 7,04% kén; fajlagos optikai forgatóképessége [a]^ = = +86,2° (c=l súly/tf% víziben); ásványolajos szuszpenzióban infravörös-abszorpciós spektruma, a következő jellemző sávokat adja mikronokban kifejezve: 3,15, 5,70, 6,30, 7,22, 7,64, 9,05, 9,40, 9,65 és 11,60. Ugyancsak a találmány oltalmi körébe tartozik az eljárás kertészetben alkalmazható készítmények előállítására, .melyek felületaktív anyagot és aktív összetevőként A16886I és/vagy A16886II antibiotikumot vagy ezek egy sóját tartalmazzák. Az A16886 amfoter molekulájú, kéntartalmú peptid antibiotikum. Mint a legtöbb antibiotikumtermelő tenyészet esetén, a Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 fermer tációja ugyancsak egy sor antibiotikus hatású anyag, ún. „faktor" képződéséhez vezet. A f^rmentorból a találmány szerint előállított A16886 antibiotikum a fentiekben említett két fő antibiotikus hatású anyagot, azaz A16886I-et és A16886II-t, másnéven I és II faktort tartalmaz. Ezenkívül néhány fermentációbán még más kisebb menynyiségű antibiotikus anyag is megfigyelhető, de mivel ezek igen kis mennyiségben vannak jelen, nem határoztuk meg őket. Ezért az itt alkalmazott „A16886 antibiotikum" kifejezés olyan antibiotikumot jelent, melyet a fermentorból nyertünk, és amely általában 1—99% I faktort és 99—1% II faktort tartalmaz, kis mennyiségű egyéb faktor mellett. Az összes százalék 100. Ennek megfelelően, a felhasználás területének és módjának tárgyalásánál az „A16886 antibiotikum" kifejezés egyaránt vonatkozik az egyes faktorokra, valamint a keverékekre is, amennyiben az egyes faktorok és a keverékek tulajdonságai hasonlóak. r^z A16886 antibiotikumot alkalmazhatjuk önmagában, vagy valamilyen sója. pl. savaddíciós sója vagy egy kationnal alkotott sója formájában. Kationnal alkotott só esetén a só monovagy di-só lehet. Előnyösen a sókat rendszerint közvetlenül a tisztítási eljárás során képezzük úgy, hogy az antibiotikumot sójaként izoláljuk. 5 Az A16886 antibiotikumot ilyen módon monoammóniumsójaként választjuk el, és ezért az alábbiakban monoammóniumsóként jellemezzük. Bizonyos meghatározásokat végeztünk az I és II faktorok keverékében. Így például több 10 kvalitatív kémiai vizsgálatot végeztünk az I faktor monoammóniumsójának és a II faktor monoammóniumsójának keverékében: a teszt pozitív volt ninhidrin, Pan Dutcher, Benedict, Molisch, Fehíing, danzilklorid, jód és "vas-III-13 -klorid reagensekkel, de negatív eredményt kaptunk biuret és Sakaguchi reagensekkel. A szobahőmérsékleten kalciumklorid felett kb. 15 órán át vákuumban szárított I és II faktor monoaimimónitumsóiniaik keveréke [a]2nD=+110,l L 20 (c = 1 s/tf% vízben) optikai forgatóképességű. Az A16886 antibiotikum I és II faktora monoammóniumsóinak keveréke pH 3—8 értéken 6 °C-on 8 napig stabil, és viszonylag stabil pH 3—8 értéken 25 °C-on 2 napig. A biológiai ak-26 tivitás lassan csökken pH 3—8 értéken, 25 °C hőmérsékleten, értéke kb. 4 nap alatt feleződik. Ezenkívül, mint az az alábbiakban látható, az I és II faktorok monoammóniumsóit külön-30 külön is megvizsgáltuk. Az A16886I és A16886II antibiotikumok monoammóniumsóinak az alábbi fajlagos optikai forgatóképesség értékeit szobahőmérsékleten vákuumban vízmentes kalciumklorid felett kb. 15 óráig szárított sókkal 3S vettük fel. Az elektrometrikus titrálást az A16886I ér A16886II antibiotikumok monoammóniumsóival 66%r-os dimetilformamid-víz oldatban 6,50 kezdeti pH-nál végeztük. Az A16886I és A16886II antibiotikumok 40 elemanalízisét vákuumban 80 °C-on foszforpentoxid felett szárított anyaggal végeztük. Az AI 68861 monoammóniumsójának analízise 5,02% metoxi-csoport jelenlétét mutatja; a metoxi jelenlétét megerősíti az NMR-spektrumban 45 3,53 ppm-nél jelentkező szinglett. Az A16886I monoammóniumsójának aminonitrogénmeghatározása Van Slyke vizsgálattal 5,3%-os eredményt ad. Az A16886I NMR-spektruma D2 0-ban felvéve 50 a következő értékeket adja: 5,19 ppm (1H, szinglett); 4,94, 4,74 ppm (2H, AB kvartett, J = 13 Hz); 4,0—4,2 ppm (1H, multipk ,t); 3,68, 3,32 ppm (2H, kvartett. J=18 Hz); 3,53 ppm (3H, szinglett); 2,64—2,i ppm (2H, multiplett); 55 2,1—1,6 ppm (4H, multiplett). Az AI 68861 antibi ikum monoammóniumsójának ásványolajban felvett infravörös spektruma a mellékelt 1. ábrán látható. Az Al 68861 antibiotikum monoammóniumsója 60 UV-abszorpciós spektruma 242 n%«-nál (EJ% = 132) és 264 nv-nál (Ej0 ^ m =165) ad maximumot vizes oldatban; a cirkuláris dikroizmust ugyancsak vizes oldatban mértük, amely 263 m,«-nál pozitív, 236 m,«-nál pedig negatív Cot-65 ton-effektust mutatott 2
